杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用。所述杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.9105。基于所述杂交瘤细胞株产生的抗Nodal的单克隆抗体，所述抗Nodal的单克隆抗体与抗Nodal的多克隆抗体组成一种新的可应用于检测肿瘤细胞的试剂盒。本发明专利技术提供单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1∶1024000，在westernbolt检测中，本发明专利技术提供的抗体仅在目标位置检测到特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。所述试剂盒可以较好地用于血清中Nodal蛋白的含量检测，且具有较高的灵敏性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal抗体和检测肿瘤细胞方面的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的抗Nodal单克隆抗体和多克隆抗体及检测肿瘤细胞方面的应用。
技术介绍
目前，早期诊断癌症的最便捷的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，肿瘤标志物是指在肿瘤发生、发展过程中能反映细胞恶变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标记物的检测，可以对辅助相应肿瘤做早期诊断、判断预后、检测疗效和肿瘤复发状况的判断等。Nodal属于TGF-β家族成员，它是一胚胎期高表达、而在成体组织中几乎没有表达的蛋白质。Nodal在细胞内以无活性的前体形式存在，在经过一系列加工修饰除去N端信号肽和一段包含200多个氨基酸的前肽序列后，便形成由110个氨基酸的成熟Nodal蛋白被分泌至胞外，成熟Nodal蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，分子量约为12kDa（人和小鼠的结构非常接近，氨基酸一致性达98.29%）。其中，通过比对TGF-β家族蛋白分析所得Nodal高特异性序列如SEQIDNO:2所示。Nodal蛋白的功能是介导胚胎发育中外胚层的上皮细胞向内、外胚层之间迁徙以形成间质组织。已知在胚胎发育过程中，Nodal信号主要通过细胞膜上丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶样I型受体（ActRI）和II型受体（ActRII）的介导传入胞内。活化的ActRI（ALK4或ALK7）随即激活胞内调节蛋白Smad(Sma/MothersAgainstDecapenta-plegic)家族的Smad2/Smad3复合物。此后该复合物与Smad4形成具有活性的三聚体并转运至胞核内，结合到目的基因的顺式作用元件或启动子区域，调控相关基因的转录，参与了肿瘤恶性生物学行为的发生过程。新近，人们发现Nodal蛋白在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、胃癌、神经胶质瘤等多数肿瘤中再度表达，且其表达水平与肿瘤浸润、转移和预后不良有关系。因此，通过检测血清中Nodal蛋白的表达情况，有望成为一种更加快速、方便、准确广泛的肿瘤体外普查诊断方法。目前，对血清中蛋白的表达情况监测方法通常需要用到抗体，因此，研制一种效价高、特异性好的Nodal蛋白抗体十分必要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，针对Nodal蛋白抗体及其相关技术的不足，提供一种杂交瘤细胞株，基于所述杂交瘤细胞株，可以产生优异的抗Nodal的抗体。本专利技术要解决的另一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术要解决的还一技术问题是提供抗Nodal的单克隆抗体或多克隆抗体的应用。本专利技术基于上述应用，提供一种将可以应用于用于肿瘤检测方面的试剂盒。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO.9105。本专利技术提供优选的上述杂交瘤细胞的制备方法为：以SEQIDNO:1所示序列的成熟Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行活性筛选得到第一阳性克隆，以SEQIDNO:2所示序列的特异性Nodal蛋白为待测物，采用Elisa法进行特异性筛选得到阳性克隆，经3次亚克隆至阳性克隆率为100%，制得杂交瘤细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.9105。本专利技术提供一种抗Nodal的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCCNO.9105的杂交瘤细胞株产生。基于所述杂交瘤细胞产生的所述单克隆抗体的类型为IgG，具有良好的特异性与较高的效价。经检测，其效价可达1:1024000，在WesternBlot检测中，本专利技术提供的抗体仅识别目标位置的Nodal特异性条带，且在稀释2000倍后仍显示良好的特异性。本专利技术提供所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，尤其是在制备检测Nodal蛋白的检测工具中具有较好的应用。本专利技术提供的单克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。本专利技术提供所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S01：以Nodal蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾细胞；S02：将小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合，获得所述杂交瘤细胞AH12，体内诱生或体外培养，经纯化，即得所述单克隆抗体。作为优选，免疫的剂量为200μg/只小鼠，免疫的次数为4次。作为优选，小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合的体积比例为5:1。作为优选，融合的融合剂为质量分数为50%的PEG4000。作为优选，Nodal蛋白与弗氏完全佐剂的体积比为1:1。作为优选，融合后、筛选前还包括HAT培养的步骤S03，具体为用HAT选择培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养，融合后第3d开始每隔2d更换新鲜HAT培养基。作为优选，体内诱生具体为：取10周龄左右BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，注射量为0.5mL/只；1周后用PBS缓冲液重悬CGMCCNO.9105的杂交瘤细胞株至细胞密度为1×106个/mL，每只小鼠腹腔注射1mL；10d～15d后待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，2000rpm/min离心10min，取上清。作为优选，纯化采用ProteinA柱。本专利技术还同时提供了一种抗Nodal的多克隆抗体。所述多克隆抗体的制备方法为：以Nodal蛋白免疫新西兰兔，免疫4次后收集血清，经ProteinA柱亲和纯化，即得。本专利技术提供的多克隆抗体效价可达1:32000。本专利技术提供所述多克隆抗体在制备检测Nodal蛋白的检测工具中的应用。本专利技术提供所述多克隆抗体在制备检测肿瘤细胞的试剂中的应用。作为优选，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。优选的，肿瘤为为结直肠癌、卵巢癌或乳腺癌。本专利技术还提供了一种用于肿瘤检测的试剂盒，包括：本专利技术提供的单克隆抗体或本专利技术提供的多克隆抗体。由于本专利技术提供的单克隆抗体或多克隆抗体具有良好的效价、纯度和特异性。因此，本专利技术提供的试剂盒具有较高的特异性和检测的准确度。作为优选，试剂盒中还包括以下包被液和封闭液等组成；所述包被液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST；所述封闭液包括质量分数为5%的BSA和质量分数为0.5%的PBST。优选的，本专利技术提供的用于肿瘤诊断的试剂盒中还包括：HRP标记的羊抗鼠抗体、nodal标准品、底物缓冲液、体积分数为30%的双氧水、邻苯二胺、摩尔浓度为2M的浓硫酸。其中，底物缓冲液的配制方法为：称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即得。本专利技术还提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S11：以包被液稀释本专利技术所述多克隆抗体，4℃放置16h，将该多克隆抗体包被至96孔板，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；S12：加入封闭液，37℃封闭2h后，以质量分数为0.5%的PBST缓冲液洗涤3次，每次5min；S13：加入待测样品、由保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9105。

【技术特征摘要】
2014.06.04 CN 201410243995.41.一种杂交瘤细胞株AH12，于2014年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO.9105；所述杂交瘤细胞株AH12应用于产生类型为IgG的单克隆抗体。2.一种抗Nodal的单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生，类型为IgG。3.权利要求2所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测Nodal蛋白方面的检测工具或在制备检测肿瘤细胞的试剂方面的应用。4.根据权利要求3所述抗Nodal的单克隆抗体的应用，其特征在于，肿瘤为结肠癌、直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、肾癌或黑色素瘤。5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜军，蔡绍晖，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44