基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法技术

基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法，属于电化学免疫分析技术领域，将不同形貌、性能优良的氧化锌纳米材料修饰玻碳电极固定牛伽马干扰素抗体，制备得到新颖的电化学阻抗型免疫传感器，可将其应用于牛伽马干扰素的无标记电化学免疫分析，该免疫传感器无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。

【技术实现步骤摘要】
基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法
本专利技术属于电化学免疫分析
，特别是传感器的制备技术。
技术介绍
结核病是对奶牛健康和产乳品质影响最为严重的传染疾病之一。牛伽马干扰素（BoIFN-γ）是在特定诱生剂刺激作用下，由T细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白，是发现最早、关注最多的细胞因子。目前，牛伽马干扰素的检测常用生物学分析方法，这些生物学分析方法灵敏度低，费力、耗时、且难于标准化。另外，它们对检测样品中的缓冲剂和其它细胞因子敏感，容易受到干扰。虽酶联免疫吸附分析也被建立来检测牛伽马干扰素，但是这些方法同样操作繁琐，费力、耗时，并且灵敏度也不能令人满意。由于牛伽马干扰素分子量较小，且在机体体液中的量极少，目前测定牛伽马干扰素的方法灵敏度距离临床实际应用还有较大差距。因此，当前急需建立一种超高灵敏度、快速、可靠的方法检测牛伽马干扰素，为牛结核病的早期诊断提供一个平台。近年来，电化学阻抗免疫分析法由于其无需标记，灵敏度高，特异性好，样品消耗量小、简单快速等特点，成为一种极有竞争力的现场检测方法。氧化锌纳米材料是具有独特化学、生物、物理和机械性能的纳米材料，为电化学免疫分析研究提供了新研究途径。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提出能克服上述牛伽马干扰素检测方法的缺陷，构建一个基于不同形貌氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素电化学阻抗免疫传感器。本专利技术的技术方案是：将氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽马干扰素抗体，即得到电化学阻抗免疫传感器。本专利技术采用不同形貌、性能优良的氧化锌纳米材料，比如棒状氧化锌、颗粒状氧化锌及管状氧化锌纳米材料等，氧化锌纳米材料具有比表面积大，生物相容性好等优点，利用其固定牛伽马干扰素抗体，有利于保持抗体的生物活性，拓宽检测的线性范围，提高免疫应特异性和反应效率，减少非特异性吸附，提高检测灵敏度。本专利技术利用其固定牛伽马干扰素抗体，实现对牛伽马干扰素的定量检测。具体的制备方法包括以下步骤：1）将氧化锌纳米材料分散于去离子水中，形成含有氧化锌的混合剂；2）将含有氧化锌的混合剂均匀地涂覆于洁净的玻碳电极表面，经晾干后，再于玻碳电极表面均匀地涂覆牛伽马干扰素抗体，然后置于4℃的温度环境下干燥后，再于玻碳电极表面均匀地修饰一层萘酚膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点。通过以上工艺，可将材料和抗体牢牢固定在电极上，制得用于检测牛伽马干扰素的电化学阻抗免疫传感器。将制得的免疫传感器置于检测体系中，加入牛伽马干扰素抗原，经温育、冲洗后检测其电化学阻抗信号。以本方法制备的传感器进行测试的方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。另外，为了提高检测的准确性，本专利技术还在涂覆含有氧化锌的混合剂前，将玻碳电极先用粒径为0.05mm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极，以此取得表面洁净的玻碳电极。另外，本专利技术还提出另一专利技术目的：以上专利技术方法制得的电化学阻抗免疫传感器在牛伽马干扰素检测中的应用。其技术方案是：在以含有5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-和0.1MKCl的0.1M、pH值为7.0的PBS溶液为测试液中，以制得的电化学阻抗免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，加入牛伽马干扰素抗原，经37.5℃温育40min后，取出工作电极冲洗，然后检测工作电极的电化学阻抗信号。由于本专利技术对缓冲溶液的pH、温育温度和温育时间进行了优化，并获得了最佳的牛伽马干扰素检测条件，提高了分析效果。该方法无需标记、简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好，可以用于牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究。因此，本专利技术利用氧化锌纳米材料固定牛伽马干扰素抗体，构建一个无标记电化学阻抗免疫传感器实现对牛伽马干扰素的定量检测，对牛结核病的早期诊断和牛细胞免疫机理的研究具有重要意义。附图说明图1为牛伽马干扰素免疫传感器制备原理图及无标记阻抗免疫分析示意图。图2为本专利技术方法制备的BoIFN-γ免疫传感器的线性拟合图。具体实施方式实施例1：（1）制备颗粒状氧化锌纳米材料。称取0.5g亚微米氧化锌粉末(ZnO)于容积为50mL的聚四氟乙烯衬里的不锈钢反应釜中，加入40mL20%H2O2水溶液，搅拌5min。然后将其置于烘箱中在120℃下反应6h，待反应体系自然冷却至室温，抽滤，用去离子水洗涤数次，最后烘箱中80℃干燥10h，得到ZnO2白色粉末。称取0.5g上述120℃水热反应6h所制的ZnO2，置于25ml的刚玉坩埚中。然后将其放入马弗炉中在300℃下加热6h，待反应体系自然冷却至室温后取出，得ZnO白色粉末。（2）在超声下，将颗粒状氧化锌纳米材料均匀分散于去离子水中，形成氧化锌含量为1mg/mL的氧化锌混合剂。（3）将玻碳电极用0.05mm的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极表面，制得预处理的玻碳电极。（4）将含有颗粒状氧化锌的混合剂均匀滴涂于预处理的玻碳电极表面，放置在4℃冰箱中晾干后，再取5.0μL200µg/mL的anti-BoIFN-γ，将其滴涂在电极上，至于4℃冰箱中干燥12h，之后在电极表面滴涂5.0μL1%的萘酚。待其干后将电极放入含有1wt%（即10mg/mL）牛血清蛋白的PBS中，在37.5℃水浴中温育30min以封闭电极上的活性位点，之后用去离子水洗去电极上游离的牛血清蛋白，制得BoIFN-γ免疫传感器，将其置于4℃冰箱中储存待用。（5）将制得的BoIFN-γ免疫传感器置于检测体系中，加入牛伽马干扰素抗原于37.5℃条件下温育BoIFN-γ抗原溶液40min，用去离子水冲洗后检测其电化学阻抗信号。（6）图2为实施例1制备的BoIFN-γ免疫传感器的线性拟合图，图中：横坐标是对牛伽马干扰素抗原浓度取对数后的值，纵坐标是不同浓度抗原对应的阻抗的相对变化值，相对变化值的计算公式是：,Y=74.31+16.34X为线性工作方程，为线性相关系数。可见，而本专利技术采用的是电化学阻抗法，测试液中的[Fe(CN)6]3-/4-就是活性探针分子，所以无需标记，因为无需标记，所以就比较简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好。实施例2：（1）制备棒状的氧化锌纳米材料。取3.0mmol的硝酸锌（Zn(NO3)2·6H2O）置于容积为100mL的聚四氟乙烯衬里的不锈钢反应釜中，加入80mL无水乙醇溶液，使聚四乙烯反应釜的填充度达到80%，在室温下搅拌10min，称取30.0mmol的氢氧化钠（NaOH）加入上述溶液中，室温下搅拌1h至完全溶解。然后将其至于电热恒温鼓风干燥箱中在120°C下反应12h，待反应体系自然冷却至室温后取出，抽滤，用去离子水和无水乙醇清洗数次，抽滤完将样品置于80°C烘箱内干燥12h，烘干后即可得到白色粉末状的棒状氧化锌纳米材料。（2）将棒状氧化锌纳米材料在超声下均匀分散于去离子水中，形成氧化锌含量为1mg/mL的氧化锌混合剂。（3）将玻碳电极用0.05mm的氧化铝粉抛光，用去离子水本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法，其特征在于将氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽马干扰素抗体，即得到电化学阻抗免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.基于氧化锌纳米材料的牛伽马干扰素阻抗型免疫传感器的制备方法，将氧化锌纳米材料修饰玻碳电极后，再在电极上固定牛伽马干扰素抗体，即得到电化学阻抗免疫传感器；其特征在于包括以下步骤：1）将氧化锌纳米材料分散于去离子水中，形成含有氧化锌的混合剂；2）将含有氧化锌的混合剂均匀地涂覆于洁净的玻碳电极表面，经晾干后，再于玻碳电极表面均匀地涂覆牛伽马干扰素抗体，然后置于4℃的温度环境下干燥后，再于玻碳电极表面均匀地修饰一层萘酚膜，最后，采用牛血清蛋白封闭活性位点。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在涂覆含有氧化锌的混合剂前，将玻碳电极先用粒径为0.05mm的氧化铝粉抛光，再以去...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，秦坯芽，陈祥，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32