植物细胞堆叠的产生和培养方法技术

本发明专利技术涉及非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和培养，及其积累或收获所期望的产物的用途。特别地，本发明专利技术提供去除了培养基且多孔结构的、非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生方法，和所述细胞堆叠的后续维持方法，该方法包括下述步骤：(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供细胞堆叠，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g～0.9g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度，从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质，以及(ii)将所述去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠在非液体环境中以50～100％的相对湿度进行培养。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】植物细胞堆叠的产生和培养方法
本专利技术涉及植物生物
特别地，本专利技术涉及非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和培养，及其积累或收获所期望的产物的用途。
技术介绍
在过去的十年里，一直致力于建立和培养用于积累和收获天然或异源蛋白质和次生代谢物的以植物为基础的系统。文献提供了大量的证据材料，证明利用以植物为基础的系统产生各种所期望的物质，该所期望的物质或是被分泌到培养基中，或是从生产的细胞、组织、细胞器、甚至整个植物或植物的一部分中被分离出来。同样存在大量的转化方案，以确保建立稳定转化或瞬时转化的植物材料。然而，仍需要可靠、相对合算且快速的技术以从植物细胞高收率地获得所期望的产物。因此，本专利技术提供一种以植物为基础的系统，以产生高水平的所期望的天然或重组产物，该系统利用来自植物细胞悬浮培养物的细胞并克服了现有技术中的问题，特别是对于培养和后续处理中处理大量培养基的需要，该系统包括产品的去除、提取和纯化。相应地，本专利技术涉及天然或重组蛋白质和代谢物的表达或产生，并且使用由通常建立的植物细胞悬浮培养物作为生产宿主而得到的特定植物细胞材料。与目前使用和开发的以使用完整植物或至少完整的分化植物组织为基础的众多系统不同，利用悬浮细胞具有能够在可控(controlled)、无菌的受控(contained)条件下可重复地产生均质材料的优点。目前，在植物中表达重组蛋白有两种主要的策略，即，(i)生产稳定的转基因植物或悬浮细胞株，或(ii)在用细菌(例如农杆菌)、病毒(例如烟草花叶病毒、马铃薯病毒X/Y、豇豆花叶病毒等等)或二者组合(例如侵染(magnifection))感染植物表达宿主(植物、组织或细胞)使宿主能够表达异源遗传信息(DNA或RNA)后，瞬时表达异源基因。虽然本专利技术也包括稳定转化的植物细胞材料的用途，但是用于瞬时表达的系统具有速度优势(基因到产品、抢占市场、紧急应对)以及有可能达到比通常稳定转化的转基因植物或其部分(如细胞)能够获得的高得多的积累水平。根据优选实施方式，本专利技术结合了植物悬浮培养物的固有优点和瞬时表达系统的优点。已经尝试并公开了将农杆菌加入到植物悬浮培养物中，接着在悬浮物中进一步培养植物细胞和细菌的方案(参见US6740526B1)，但所述方法的转化效率低。此外，除非采取有效的措施，例如使用抗生素杀灭细菌或使用营养缺陷型菌株抑制生长，农杆菌会迅速地长得超过植物悬浮细胞。其他人描述了共培养的细菌对植物悬浮细胞的直接有害作用(细胞死亡，过敏性反应)。结果，目前尚不存在以植物为基础的生产系统，其结合完整植物或组织的瞬时农杆菌渗入/病毒感染的效率和植物悬浮培养物的优点，使得能够优选在无菌可控条件下生产均质的生物质，这是建立符合GMP标准的生产的巨大优势。如上所述，US6740526B1中公开的共同发酵方法存在转化效率低和伴随细菌过度生长的问题，尽管以叶为基础的系统实现高转化效率，但是，在扩大规模方面遭遇问题，存在初始生物质生产的时空产率低、且依赖于在可控但并非无菌的条件下生产植物生物质的问题。与微生物系统相比生产成本高是这些系统没有得到广泛关注和作为生物制品的生产系统使用的主要原因。因此，研究和开发着眼于速度和生产鲁棒性(productionrobustness)的综合优势是很重要的更专业应用，即紧急应对(如流感疫苗，新出现的疾病，个体化用药等)。本专利技术处理并解决了这些问题，并且提供用于操纵任何指定植物宿主材料的遗传背景的改进手段。
技术实现思路
根据本专利技术，提供用于去除了培养基且多孔结构的非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生以及所述细胞堆叠的后续维持的方法，该方法包括下述步骤：(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供具有多孔结构的细胞堆叠，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g～0.9g湿细胞重量/cm3、优选0.2g～0.85g湿细胞重量/cm3、更优选0.4g～0.8g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度，从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质；以及(ii)在提供足够的湿度(例如50～100％的相对湿度)以防植物材料严重脱水的同时，在非液体环境中于维持或恢复所述细胞堆叠的多孔结构的条件下培育或培养所述去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠。本领域技术人员已知，组织内的细胞通常紧密相连，通常分化并经常呈现出特定形态和极性的细胞。此外，组织内的细胞通常具有相对于彼此的特征定位。相反，本专利技术的细胞堆叠是由植物细胞悬浮培养物产生的。植物细胞悬浮培养物的特有性能是单个细胞或一些细胞的聚集体相对于彼此移动或可移动，并没有表现出更高的组织水平。因此，本专利技术的细胞堆叠包括彼此间没有特定的相对定位的单个细胞和细胞簇。这些细胞按所得集合体堆叠成具有大量气隙的三维多孔结构的方式铸型(cast)。在细胞堆叠密度和气隙存在之间有明显的相关性。气隙因为以下几个原因而非常重要。首先，能够进行有效率的气体交换，从而可以容易地将足够量的氧气提供给细胞。其次，气隙可以暂时性且容易地再次被液体(处理)充满。这种暂时的处理可用于使各种试剂与细胞堆叠的所有细胞紧密接触，从而提供有效率的遗传转化方法、生物转化方法、通过洗脱或清洗细胞堆叠而回收产物的方法，以及为诊断目的利用底物或分解物(例如以细胞堆叠为基础的免疫测定)。重要的是这些处理都只是暂时的，以及重新构筑细胞堆叠的多孔结构，并确定细胞堆叠的密度以确保在后续培育步骤中的高生存能力。由于细胞堆叠的多孔性，在某些应用中更重要的是湿度足够高，以防止细胞堆叠因为在细胞/气隙的界面与气相接触的表面积大而变干。特别是本专利技术方法的优选实施例包括(i)第一培养步骤，优选在受控和/或无菌的条件下，对植物细胞悬浮物进行培养，以提供均匀的植物生物质，(ii)分离步骤，将液体培养基从植物细胞中分离出来，生成密度在0.1～0.9g湿细胞重量/cm3之间、优选在0.2～0.85g湿细胞重量/cm3之间、最优选在0.4～0.8g湿细胞重量/cm3之间的多孔细胞堆叠，以及(iii)第二培养步骤，在非液体环境中受控条件下将细胞堆叠进一步再培育(见上文)至少一天。根据实际情况和实际操作者的意图，可以将第二培养步骤进行几天。第二培养步骤通常进行2～7天，优选3～5天。在当前最先进的所有培养方法中，植物细胞材料都是连续不断地(亦即大部分时间)与含有培养基的营养物直接或间接(多孔载体或膜介导)接触。连续的培养基接触仅在细胞从一个培养基转移到另一个培养基时才会短暂(即短时间)地中断。可以对细胞进行过滤或清洗以移除“旧的”培养基，但随后迅速转移到新的培养基中。与现有技术相比，培养步骤是在保持细胞的生存能力、并以降低的或最小的细胞生长和分裂促进产物积累的条件下进行的。通过在潮湿的环境中、优选不接触成分或营养物从其中扩散到细胞堆叠的液体或凝胶化的生长培养基地培育良好地通气的堆叠细胞而实现的(US2002/092037A1，WO2005/103271A1)。在现有技术中，细胞薄层被铺板或点样在放置于培养基中的支持(supportive)膜以给细胞提供营养物。然而，在生长培养基中培养细胞层具有因为需要接触该培养基，所以只有少量的生物质能够被处理的缺点。与此相反，本专利技术的细胞堆叠方法不依赖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除了培养基且多孔结构的、非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和所述细胞堆叠的后续维持的方法，该方法包括下述步骤：(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供具有多孔结构的细胞堆叠，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g～0.9g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度，从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质，以及(ii)将去除了培养基且多孔结构的所述细胞堆叠在非液体环境中以50～100％的相对湿度进行培育。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.31 EP 12000618.4;2012.01.31 US 61/592,7801.一种去除了培养基且多孔结构的、非组织多层细胞堆叠形式的植物细胞材料的产生和所述细胞堆叠的后续维持的方法，该方法包括下述步骤：(i)通过从植物细胞悬浮培养物中分离细胞而提供具有多孔结构的细胞堆叠，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于0.1g～0.9g湿细胞重量/cm3的细胞堆叠密度，从而建立所述细胞堆叠的去除了培养基且多孔结构的性质，以及(ii)将去除了培养基且多孔结构的所述细胞堆叠在非液体环境中以50～100％的相对湿度进行培育，其中，培养步骤(ii)是在没有将去除了培养基且多孔结构的细胞堆叠放置在维持培养基或生长培养基上或者没有接触维持培养基或生长培养基的情况下实施的。2.根据权利要求1所述的方法，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于在0.2g～0.85g湿细胞重量/cm3之间的细胞堆叠密度。3.根据权利要求2所述的方法，其中，使细胞堆叠所包含的液体的含量降低并调整为相当于在0.4g～0.8g湿细胞重量/cm3之间的细胞堆叠密度。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，从所述植物细胞悬浮培养物中分离的细胞是天然的或转基因的，并且能够积累所期望的产物。5.根据权利要求1所述的方法，其中，从所述植物细胞悬浮培养物中分离的细胞是天然的或转基因的，并且能够积累所期望的产物。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述转基因细胞被瞬时转化或稳定转化以积累所述所期望的产物。7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述转基因细胞被瞬时转化或稳定转化以积累所述所期望的产物。8.根据权利要求1所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·拉德马赫尔，
申请(专利权)人：弗劳恩霍夫应用研究促进协会，
类型：发明
国别省市：德国;DE