本发明专利技术公开了氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的鸭疱疹病毒1型(AHV-1)UL7截短重组蛋白，其编码基因，重组表达载体，工程菌，并利用工程菌制备该截短重组蛋白以及该截短重组蛋白的多克隆抗体；该截短重组蛋白具有与天然AHV-1UL7蛋白相似的免疫反应活性，能够与AHV-1抗体特异性结合，可作为检测AHV-1抗体的试剂应用，由于该截短重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险，且制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较；该截短重组蛋白的多克隆抗体可作为检测AHV-1抗原的试剂，具有特异性好，与鸭肝炎病毒、雏鹅新型肠炎病毒不产生交叉反应，还可作为检测UL7蛋白在AHV-1感染宿主细胞中的定位和分布的试剂应用。
【技术实现步骤摘要】
鸭疱疹病毒1型UL7截短重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种病毒截短重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
鸭抱疫病毒I型(Anatid Herpesvirusl, AHV-1)属抱疫病毒科、ct -抱疫病毒亚科、马立克病毒属，可引起鸭、鹅和天鹅等水禽发生一种急性、热性、接触性传染的败血性传染病，病鸭临床表现为精神沉郁，高热稽留，共济失调、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大，临床以急性败血症过程为主要特征，流行于世界大多数养鸭、鹅地区及野生水禽的主要迁栖地，传播迅速，发病率和死亡率可高达90 %以上，常造成严重经济损失，严重威胁我国水禽养殖业的生存和发展。AHV-1抗原或抗体检测对其防治很关键。抗体检测的主要方法有琼脂凝胶扩散试验、中和试验(neutralizat1n test,NT)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)测定法。其中,ELISA法广泛用于AHV-1抗体检测,可用于大批鸭群和鹅群抗体水平的监测以及基层单位检疫。但是，以往的ELISA方法使用全病毒作为包被抗原，全病毒抗原纯度有限、稳定性差、难以标准化，影响检测结果的准确性，且操作费时费力，进一步限制了该方法的大规模应用，因此，一种新型抗原的制备方法对建立特异敏感的检测方法从而防控AHV-1感染显得尤为重要。同样,抗原检测方法有中和试验、免疫荧光等，但检测试剂也涉及到特异性强的抗体且抗体(无论单抗还是多抗)的制备同样涉及到病毒抗原纯化的困难。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种AHV-1UL7截短重组蛋白，其具有与天然UL7蛋白相似的免疫反应活性，能够与AHV-1抗体特异性结合；目的之二在于提供该UL7截短重组蛋白的制备方法；目的之三在于提供该UL7截短重组蛋白在制备检测试剂中的应用；目的之四在于提供该UL7截短重组蛋白的多克隆抗体；目的之五在于提供该UL7截短重组蛋白的多克隆抗体在制备检测试剂中的应用。 经研究，本专利技术提供如下技术方案: 1.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 2.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的编码基因。 进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。 3.含有所述编码基因的重组表达载体。 4.含有所述重组表达载体的工程菌。 进一步，所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21pLysS中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET-32a(+)中而得到。 5.利用所述工程菌制备鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的方法，包括以下步骤:将工程菌接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D_达0.6，加入IPTG至终浓度为0.3mmol，37°C诱导培养3小时，收集菌液，离心，沉淀用20mmol pH8.0的Tris-HCl缓冲液悬浮，加入溶菌酶至终浓度为lmg/mL，置_20°C过夜后，在冰浴条件下超声波间歇破碎菌体，离心，沉淀洗涤后，用8mol/L尿素溶液溶解，经孔径0.45 μ m的微孔滤膜过滤，透析复性，即得鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白。 6.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的多克隆抗体。 7.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白在制备检测鸭疱疹病毒I型抗体的试剂中的应用。 8.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的多克隆抗体在制备检测鸭疱疹病毒I型抗原和/或UL7蛋白在鸭疱疹病毒I型感染宿主细胞中的定位和分布的试剂中的应用。 本专利技术的有益效果在于:本专利技术选取AHV-1UL7基因编码蛋白的主要抗原域(laa_240aa)，利用原核表达系统成功制得了 AHV-1UL7截短重组蛋白，该截短重组蛋白具有与天然AHV-1UL7蛋白相似的免疫反应活性，能够与AHV-1抗体特异性结合，可作为检测AHV-1抗体的试剂应用，由于该截短重组蛋白非全细菌，应用其进行检测时无散毒危险，且该截短重组蛋白的制备方法简单，适于工业化大规模生产，能够实现产品的标准化，利于不同实验室之间的结果比较。此外，本专利技术还通过动物免疫制备了 AHV-1UL7截短重组蛋白的多克隆抗体，该多克隆抗体可作为检测AHV-1抗原的试剂应用且具有特异性，与鸭肝炎病毒、雏鹅新型肠炎病毒不产生交叉反应，还可以作为检测UL7蛋白在AHV-1感染宿主细胞中的定位和分布的试剂应用。 【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明: 图1为UL7截短基因(下文中简称为UL7M基因)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中I为UL7M基因PCR产物，箭头所指处为UL7M片段；M为DNA Marker DL2000。 图2为克隆质粒pMD20-T-UL7M的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker DL15000 ；1为pMD20_T_UL7M用BamHI和XhoI双酶切后的产物，箭头所指处为UL7M片段。 图3为重组表达质粒pET32a_UL7M的构建示意图。 图4为重组表达质粒pET32a_UL7M的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker DL15000 ；1为pET32a_UL7M用BamHI和XhoI双酶切后的产物，箭头所指处为UL7M片段。 图5为不同诱导温度条件下重组表达质粒pET32a_UL7M转化菌株表达AHV-1UL7截短重组蛋白(下文中简称为UL7M重组蛋白)的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白Marker ;I为空载体pET-32a(+)转化菌株未经IPTG诱导；2为pET32a_UL7M转化菌株未经IPTG诱导；3和4分别为pET32a-UL7M转化菌株在37°C经IPTG诱导后超声破碎菌体、离心所得的上清与沉淀；5和6分别为pET32a-UL7M转化菌株在30°C经IPTG诱导后超声破碎菌体、离心所得的上清与沉淀；7和8分别为pET32a-UL7M转化菌株在25°C经IPTG诱导后超声破碎菌体、离心所得的上清与沉淀；箭头所指处为UL7M重组蛋白。 图6为不同IPTG浓度条件下重组表达质粒pET32a-UL7M转化菌株表达AHV-1UL7M重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白Marker ;1_9的IPTG终浓度依次为0、0.1、 0.2,0.3,0.4,0.5,0.7、1.0、1.3mmol/L ;箭头所指处为 UL7M 重组蛋白。 图7为不同诱导时间条件下重组表达质粒pET32a_UL7M转化菌株表达AHV-1UL7M重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白Marker ;1_9的诱导时间依次为8、7、6、5、4、 3、2、1、0小时；箭头所指处为UL7M重组蛋白。 图8为AHV-1UL7M重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白Marker ；1为经2mol/L尿素洗漆3次后得到的纯化的AHV-1UL7M重组蛋白，箭头所指示处为UL7M重组蛋白。 图9为琼脂扩散试验检测AHV-1UL7M重组蛋白多克隆抗血清的效本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭疱疹病毒1型UL7截短重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQID N0.2所示。2.权利要求1所述的鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0.1所示。4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。5.含有权利要求4所述重组表达载体的工程菌。6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，是将重组表达载体转入大肠杆菌BL21pLysS中而得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的编码基因克隆入原核表达质粒pET-32a(+)中而得到。7.利用权利要求6所述工程菌制备鸭疱疹病毒I型UL7截短重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤:将工程菌接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，3...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪铭书，程安春，黄杰，贾仁勇，杨乔，孙昆峰，陈舜，刘马蜂，朱德康，陈孝跃，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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