一种潮汐式生物反应器及其培养百合籽球的方法技术

本发明专利技术创新性的利用潮汐式生物反应器来快速繁殖百合移栽小籽球，通过将常规固体繁殖培养基中培养生长到直径0.2～0.4cm百合小籽球作为外植体接入到潮汐式生物反应器中，在50天的培养过程中替换液体培养基配方，并通过添加药品控制污染，逐步进行籽球膨大与生根，籽球出瓶后，按照常规百合籽球春化、移栽、种植方法进行管理。本发明专利技术通过逐步进行籽球膨大和生根培养，可简化组培程序，极大的减少常规固体组织培养中的人工成本，并可有效控制污染与变异株的产生，缩短了百合繁育周期，节约了生产成本，能将百合新品种的优良性状快速固定并保持下来，解决了常规百合繁育体系生产的籽球繁育速度慢，种源混杂，籽球质量不稳定的难题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物的组织培养
，具体涉及。
技术介绍
百合是百合科百合属多年生草本鳞茎植物，是世界著名的观赏花卉，近年来，随着我国经济的发展和人民生活水平的提高，百合已成为我国花卉市场中重要的高档切花。广泛运用于庭院绿化、家庭装饰、节日用花，药用食用等领域。随着百合需求市场的不断扩大，我国西南、西北、东北等地区广泛种植鲜切花百合、食用百合和庭院绿化百合籽球。作为种源的百合籽球的安全和快速生产繁殖也越来越多的受到业界的关注。关于百合籽球的繁殖技术，国内外有许多的研究者从事了大量的研究工作，主要涉及常规的组织培养、无糖箱式组织培养、母球鳞片扦插等繁殖技术。常规的组织培养方法由于效率较低，材料及人工成本较高，提高了单株百合籽球的生产成本，无糖箱式组织培养可以减少污染，但对培养仪器，培养技术的要求较高，且生产程序相对复杂，不能满足大规模生产百合籽球的需求。面对这些问题，市场上迫切需要建立一种用简单的生产设备和技术便可大规模繁殖生产百合籽球的新工艺和新方法。目前对于专门用于百合籽球繁殖的生物反应器研发，及生物反应器培养百合籽球国内有少量报道，但利用潮汐式生物反应器及新配方来培养百合籽球的还没有报道。
技术实现思路
为克服现有百合籽球繁殖技术存在效率较低，材料、人工成本较高，生产程序相对复杂，难以规模化生产等问题。本专利技术的目的在于提供一种省时省工的百合籽球快繁方法，通过特殊的潮汐式生物反应器和培养基配方，来提高增殖率，籽球生长质量，降低生产成本，同时将优良性状的籽球固定下来，减少常规百合组织培养转接次数，操作简变易行，自动化程度高。以满足优质种苗的大规模生产需要。 本专利技术采用的技术方案如下:一种潮汝式生物反应器，其特征在于包括营养液储存容器、培养容器、抽气泵、定时器、空气过滤膜、节水阀和加液过滤器，营养液储存容器与培养容器通过安装有节水阀的导管相连，所述的营养液储存容器和培养容器各自分别通过安装有空气过滤膜的导管与对应的抽气泵相连，所述的抽气泵与定时器相连，所述的培养容器中设有与底面平行的金属纱网，所述的在营养液储存容器与抽气泵之间的导管上设有加液过滤器。 该潮汐式生物反应器繁育百合种苗主要解决百合籽球的快速繁殖技术，主要强调生物反应器的特殊构造、转接次数、液体培养基配方，减少炼苗成本。 基于上述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，包括如下步骤:A.将百合籽球中层及内层鳞片作为外植体接入培养基中，IL的培养基含有如下组分: MS培养基4.4g蔡乙酸0.0~0.lmg/L6-苄基腺嘌呤1.0~1.5mg/L 鹿糖30~60g/L 琼脂糖6g/L 去离子水余量 pH5.8 ~6.0 ;将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8~6.0即得培养基；在光照强度为2000~25001x，温度为25±2°C，光照时间为12~14h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.2~0.4cm的小籽球，切下得百合小籽球；B.在无菌环境下将下列籽球膨大培养基灌入营养液储存容器中:1L的籽球膨大培养基含有如下组分: MS培养基4.4g 萘乙酸0.1~0.2mg/L6-苄基腺嘌呤0.5~1.0mg/L 鹿糖45~60g/L 去离子水余量 pH5.8 ~6.0 ;将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8~6.0即得籽球膨大培养基；C.将A步骤培养得到的百合小籽球作为外植体，在无菌环境下置于培养容器中的金属纱网上；D.设置潮汐培养程序:每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，控制温度为25±2°C ;每天在光照强度为2000~2500 Ix的条件下进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每10~15天更换一次培养基，得到潮汐培养小籽球；E.将D步骤得到的潮汐培养小籽球在无菌环境下取出，人工去叶后再次放入培养容器中，以下列生根培养基替换籽球膨大培养基继续潮汐培养，每一小时浸没10分钟，每10天更换一次培养基，黑暗环境下连续培养20天，出瓶，得到出瓶后的百合籽球；所述的IL的生根培养基含有如下组分: MS培养基4.4g蔡乙酸0.00~0.05mg/L 鹿糖45~60g/L 去离子水余量 pH5.8 ~6.0 ;将MS培养基、萘乙酸和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8~6.0即得生根培养基；F.将E步骤得到的出瓶后的百合籽球放入质量浓度为0.1~0.2%的多菌灵溶液中消毒I~2min后，用百合基质包装，在-1°C冷库春化85~90天后，下地移栽，然后按常规进行浇水、施肥管理，即得到百合籽球。 本专利技术进一步优选的是A步骤中诱导和增殖培养时间为2.5~3.0个月。 本专利技术进一步优选的是A步骤中切下小籽球是在超净工作台上。 在潮汐培养过程中，每天进行观察，如出现轻微污染，立即通过加液过滤器加入含有1%。~5%。ppm微生物生长抑制剂的液体培养基，并培养2~3天后再换回原来的培养基继续进行培养。 所述步骤A的百合外植体通过下列常规方法获得:选择周径16~18cm健康生长的百合籽球，剥去外层及有斑点、虫洞的鳞片，将百合籽球鳞片分开，先用洗衣粉水清洗，后用清水冲洗干净，在超净环境下用质量浓度为75%的酒精擦拭材料两遍后，先放入质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒15min ;之后用无菌水冲洗3次，每次lmin，即获得百合外植体，所述的混合液为每10ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加有5滴吐温-20。 本专利技术与现有技术相比，其有益效果为:(1)用本专利技术潮汐式生物反应器技术繁殖百合籽球，在普通培养室内即可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了百合籽球无法周年进行生产的难点；(2)培养速度快，潮汐式生物反应器技术百合籽球膨大阶段30天，生根阶段20天，较常规固体培养基培养膨大阶段80~90天，本专利技术生根阶段40~45天大大缩短；(3)繁殖效率高，较常规固体培养基培养百合籽球，通常每瓶8~10个籽球，潮汐式生物反应器每批100个籽球，繁殖效率大大提高；(4)在轻微污染时，通过潮汐式生物反应器加液过滤器加入微生物生长抑制剂，可有效控制液体培养过程中污染严重问题；(5)节省大量的人力物力，潮汐式生物反应器培养百合籽球，从外植体接入到籽球出瓶，共需人工转接2次，且转接方法简便，常规固体培养基培养，由于愈伤组织丛生，转接较困难，且次数繁多，通常从外植体接入到籽球出瓶，共需人工转接4~5次，每次转接需重新配置固体培养基，从而浪费大量的人力物力；(6)解决了常规繁育体系生产的种苗亲本来源复杂，籽球质量不稳定的难题，通过本专利技术，使籽球状稳定，籽球来源单一，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了籽球质量，可为市场提供统一标准的优良百合籽球；(7)籽球田间栽培成活率较高；由于潮汐式生物反应器瓶内相对湿度远小于常规固体培养基，籽球生长环境更接近于自然环境，出瓶籽球炼苗成活率更高；(8 )本专利技术在外植体的选择方面，选择优良株系，通过本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种潮汐式生物反应器，其特征在于包括营养液储存容器、培养容器、抽气泵、定时器、空气过滤膜、节水阀和加液过滤器，营养液储存容器与培养容器通过安装有节水阀的导管相连，所述的营养液储存容器和培养容器各自分别通过安装有空气过滤膜的导管与对应的抽气泵相连，所述的抽气泵与定时器相连，所述的培养容器中设有与底面平行的金属纱网，所述的在营养液储存容器与抽气泵之间的导管上设有加液过滤器。

【技术特征摘要】
1.一种潮汝式生物反应器，其特征在于包括营养液储存容器、培养容器、抽气泵、定时器、空气过滤膜、节水阀和加液过滤器，营养液储存容器与培养容器通过安装有节水阀的导管相连，所述的营养液储存容器和培养容器各自分别通过安装有空气过滤膜的导管与对应的抽气泵相连，所述的抽气泵与定时器相连，所述的培养容器中设有与底面平行的金属纱网，所述的在营养液储存容器与抽气泵之间的导管上设有加液过滤器。2.基于权利要求1所述的潮汐式生物反应器培养百合籽球的方法，其特征在于包括如下步骤: A.将百合籽球中层及内层鳞片作为外植体接入培养基中，IL的培养基含有如下组分: MS培养基4.4g 蔡乙酸0.0~0.lmg/L 6-苄基腺嘌呤1.0~1.5mg/L 鹿糖30~60g/L 琼脂糖6g/L 去离子水余量 pH5.8 ~6.0 ; 将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、蔗糖和琼脂糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8~6.0即得培养基； 在光照强度为2000~25001x，温度为25±2°C，光照时间为12~14h/d的条件下，进行小籽球诱导和增殖培养，直至外植体萌发分化出0.2~0.4cm的小籽球，切下得百合小籽球； B.在无菌环境下将下列籽球膨大培养基灌入营养液储存容器中:1L的籽球膨大培养基含有如下组分: MS培养基4.4g 萘乙酸0.1~0.2mg/L 6-苄基腺嘌呤0.5~1.0mg/L 鹿糖45~60g/L 去离子水余量 pH5.8 ~6.0 ; 将MS培养基、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤和蔗糖溶于去离子水中，搅拌至混合均匀，并调节pH为5.8~6.0即得籽球膨大培养基； C.将A步骤培养得到的百合小籽球作为外植体，在无菌环境下置于培养容器中的金属纱网上； D.设置潮汐培养程序:每两小时浸没百合小籽球30分钟，每天12个循环，控制温度为25±2°C ;每天在光照强度为2000~2500 Ix的条件下进行16小时光照培养，然后再黑暗培养8小时；潮汐培养30天，每10~15天更换一...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾文杰，蒋亚莲，崔光芬，赵培飞，王祥宁，段青，马璐琳，杜文文，王继华，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53