一种蛋白质样品原位快速预处理方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质样品原位快速预处理方法，于离心超滤装置内原位进行蛋白质样品的整个预处理过程，集成了蛋白质样品变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，并采用微波辅助加速蛋白质样品的酶解。该方法可显著提高蛋白质样品预处理的通量，同时，整个样品预处理过程原位进行，回收率高。此外，离心超滤装置的使用可方便、快捷地实现样品的纯化及溶剂的置换，酶解产物无需额外的纯化过程，可直接与后续的高效液相色谱分离-质谱鉴定联用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
蛋白质的鉴定与社会人群的健康息息相关。对于大部分遗传疾病，如肿瘤和肥胖症，患者与健康人群的某些特定蛋白存在差异性表达。为实现疾病的“早发现，早治疗”，对特定蛋白质的快速及高灵敏度的鉴定具有重要意义。作为蛋白质分析的首要步骤，蛋白质样品预处理可实现杂质的去除及样品的富集，因此建立高效快捷的蛋白质样品预处理方法，在实现高灵敏度、高准确度的差异性蛋白质的研究过程中发挥重要作用，进而推动疾病的发现与治疗上的深入研究。 目前，基于凝胶的样品预处理和基于自由溶液的样品预处理是蛋白质组常用的两大技术。然而，胶上酶解耗时长，后续处理复杂，且样品损失严重。此外，酶解效率与肽段的提取效率有待提高；自由溶液酶解具有酶解时间长(通常需要1h以上)的缺点，无法满足快速处理的要求。近些年来发展的酶反应器具有酶解时间短，酶解效率高，可与多维分离平台联用，实现自动化等优点。然而，酶反应器基质材料的非特异性吸附问题会造成酶解重现性差，不利于样品的分析。(Liang, Y; Tao, D.Y.;Ma, J.F.; Sun, L.L.; Liang, Z.; Zhang, L.H.; Zhang, Y.K.J.Chromatogr.A2011, 1218 (20)，2898-2905) 近年来大量有关超滤膜的实验结果表明，超滤膜的使用具有很好的去噪效果、样品损失量较小、易实现溶剂置换的优势。同时，微波辅助由于其高效性早已被用于样品预处理过程中。本专利技术结合了超滤膜的去噪性能和微波水浴辅助酶解的高效性，并提出了样品在膜上原位进行样品预处理所有步骤，进一步减少样品的损失量，从而发展出一种新型样品预处理方法，具有高效、快速、回收率高的优点。
技术实现思路
为了克服蛋白质样品预处理过程耗时长，操作繁琐，损失量大等不足，本专利技术提供，于离心超滤装置中集成了蛋白质的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除整个样品预处理过程。同时，采用微波水浴辅助酶解，可有效降低酶解时间，提高酶解效率。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: (I)蛋白质样品的原位富集:采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%_30%的表面活性剂(十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、TritonX-100, chaps、Rapigest SF或NP_40d)或去垢剂(尿素、硫脲或盐酸胍)的碱性溶液溶解蛋白质样品，将蛋白质样品溶液加入至超滤管中实现蛋白质的原位富集； (2)溶剂的置换:蛋白质样品溶液经步骤(I)处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行PH置换，即若蛋白质溶解液体系为PH为1-6.5的酸性溶液(甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液)，而后续还原过程所需溶液体系为碱性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的PH为7.5-14的碱性缓冲溶液(碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)；若蛋白质溶解液体系为PH为7.5-14的碱性缓冲溶液，而后续还原过程所需溶液体系为酸性环境，则在蛋白质原位富集后将离心超滤装置离心，待超滤管内溶剂全部离心至收集管后，向超滤管中加入体积为1-20倍蛋白质溶解液体积的pH为1-6.5的酸性溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行PH置换； (3)蛋白质样品的变性及还原:向步骤(2)中处理的样品溶液中加入还原剂(二硫苏糖醇(DTT)、磷酸三氯乙酯(TCEP)或β-巯基乙醇)，在高温水浴下，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程； (4)杂质的去除:将步骤(3)中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入体积为蛋白质样品还原体系溶液体积的1-20倍的pH为7.5-14的碱性缓冲溶液(碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)或水溶液并离心，去除蛋白质溶液中的小分子杂质； (5)蛋白质样品的烷基化及酶解:向步骤(4)中离心后的超滤管中加入以pH为 7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液(碘代乙酸或碘乙酰胺)及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程； (6)酶解肽段的收集:微波水浴结束后，将离心超滤装置进行离心，保留收集管中所得溶液，向超滤管中加入蒸馏水后，再次进行离心，保留收集管中所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。 本专利技术具有以下优点: 1、样品损失小。整个蛋白质样品预处理过程包括蛋白质样品的变性、还原、烷基化、酶解及除盐过程皆在离心超滤装置中原位进行，有效减少样品转移造成的损失。 2、可实现溶剂的置换及杂质的去除。离心超滤装置的引入，可以通过离心去除溶齐U，从而实现酸碱溶剂的置换；同时，由于离心超滤装置中的超滤膜具有截留大分子的功能，可实现小分子杂质的去除。 3、通量高。蛋白质样品的变性及还原过程同时进行，烷基化及酶解过程微波辅助下同时进行，整个样品预处理过程可在Ih内完成。 4、处理全蛋白质组。使用蛋白质原位预处理方法可处理可溶性蛋白质及膜蛋白质。 5、酶解效率高。酶解过程在微波水浴辅助下进行，酶解时间缩短至lmin，酶量提闻，从而提闻酶解效率。 6、处理微量样品。蛋白质样品酶解后加水进行冲洗，可有效增加酶解产物含量，同时降低样品中盐的浓度，减少了除盐步骤，进一步减少样品损失，利于微量样品的处理。 【附图说明】 图1为离心超滤装置示意图； 图2为蛋白质原位样品预处理流程图。 图中1:超滤管2:收集管3:蛋白质的变性及还原4:杂质的去除5:蛋白质的烷基化及酶解6:样品的冲洗7:酶解产物的收集。 【具体实施方式】 本专利技术采用的离心超滤装置为商品化(购自Millipore，Billerica, MA)的由超滤管及收集管组成的纯化装置；超滤管为底部置有热密封超滤膜(超滤膜为再生纤维素膜)的圆柱体结构； 使用时,超滤管置于收集管内。 1.蛋白溶液的配制 将大肠杆菌蛋白质样品(购自Sigma, St.Louis, MO)溶解于1mM碳酸氢铵缓冲溶液(ABC)中(pH8.7)，BCA法测定其浓度后，以1mM ABC为溶剂配制蛋白质样品浓度为Img/ mLo 2.蛋白溶液的变性及还原 取步骤I中制备的大肠杆菌蛋白溶液30 μ L(即30 μ g样品)置于超滤管中，并加Λ 1mM ABC补齐至60 μ L溶液，加入IM 二硫苏糖醇(DTT)(溶解于1mMABC) 6 μ L (终浓度为10mM)，在95°C水浴下反应5min。 3.杂质的去除 步骤2中处理的样品在HOOOXg转速下离心lOmin，弃去收集管中废液。向超滤管中加入200 μ LlOmM ABC，在14000 Xg转速下离心15min，弃去收集管中废液。 4.蛋白溶液的烷基化及酶解 向步骤3中离心后的超滤管中加入SOyLlOmM碘代乙酰胺(IAA)(溶解于1mMABC)溶解的30 μ g胰蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于：整个蛋白质样品预处理过程，包括蛋白质样品的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括：（1）采用pH为1‑6.5的酸性溶液或pH为7.5‑14的溶有体积浓度为1%‑30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解蛋白质样品，将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中实现蛋白质的原位富集；（2）蛋白质样品溶液经步骤（1）处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行pH置换，即将离心超滤装置离心后向超滤管中加入pH为蛋白质样品还原过程所需pH范围的溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换。（3）向步骤（2）中处理的样品溶液中加入还原剂，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；（4）将步骤（3）中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入pH为7.5‑14的碱性缓冲溶液或水溶液并离心，实现杂质的去除；（5）向步骤（4）中离心后的超滤管中加入以pH为7.5‑9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；（6）酶解完成后，将离心超滤装置进行离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤管中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。...

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于:整个蛋白质样品预处理过程，包括蛋白质样品的变性、还原、溶剂置换、烷基化、酶解及杂质去除过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括: (1)采用pH为1-6.5的酸性溶液或pH为7.5-14的溶有体积浓度为1%_30%的表面活性剂或去垢剂的碱性溶液溶解蛋白质样品，将样品溶液加入至离心超滤装置的超滤管中实现蛋白质的原位富集； (2)蛋白质样品溶液经步骤(1)处理后，若蛋白质样品后续还原过程所需溶液体系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境不同，则需进行PH置换，即将离心超滤装置离心后向超滤管中加入pH为蛋白质样品还原过程所需pH沮围的溶液；若后续蛋白质样品还原过程所需溶液体 系环境与蛋白质样品溶解液体系环境所需酸碱环境相同，则不需要进行pH置换。 (3)向步骤(2)中处理的样品溶液中加入还原剂，同时进行蛋白质样品的变性及还原过程; (4)将步骤(3)中处理的样品溶液经离心后，向超滤管中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液并离心，实现杂质的去除； (5)向步骤(4)中离心后的超滤管中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，将样品转入至盛有水的微波盒，并将微波盒转入至微波炉中，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程； (6)酶解完成后，将离心超滤装置进行离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤管中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。2.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于:所述的蛋白质样品溶剂，PH为1-6.5的酸性溶液，可为甲酸、三氟乙酸、三氯乙酸或醋酸溶液；pH为7.5-14的碱性缓冲溶液，可为碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液； 所述的表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-100、chaps、RapigestSF或NP-40d ;去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍。3.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于:所述的离心超滤装置为商品化的由超滤管及收集管组成的纯化装置；超滤管为底部置有热密封超滤膜的圆柱体结构。4.按照权利要求1所述蛋白质样品原位快速预处理方法，其特征在于:步骤(1)中所述的蛋白质样品溶液在超滤管中体积范围为50 μ L-1mL,对应蛋白质样品的质量范围为1ng-1mg05.按照权利要求1所述蛋白质样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，方菲，赵群，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21