本发明专利技术公开了一种基于EST-SSR标记的甜瓜品种绿天使杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法以甜瓜品种绿天使杂交种及其双亲的基因组DNA为模板，通过GeneBank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer3.0在线引物设计，设计了57对EST-SSR引物。经过筛选，得到1对杂交种带型为双亲的互补带型引物，经田间验证试验引物稳定性良好，且与田间试验结果较为吻合，能够对甜瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明专利技术的检测方法在3h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。
【技术实现步骤摘要】
-种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子纯度鉴定的方法
本专利技术属于农业的蔬菜育种与应用
，涉及甜瓜杂交种纯度鉴定方法，更 具体的是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。
技术介绍
种子是农业生产中最基本最关键的生产资料，其纯度的高低是直接衡量种子质量 优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经 济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作 量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴 定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。 伴随着现代农业技术的不断发展，种子纯度鉴定技术由传统的形态标记鉴定逐步 发展到集形态标记鉴定、生化标记鉴定和DNA分子标记鉴定为一体的综合鉴定技术体系。 DNA分子标记是DNA在分子水平上遗传变异的直接反映，它们遗传性稳定，信息量大，不受 内外环境的影响，而且具有与基因表达与否无关、检测迅速和操作简便等突出优点，因此， DNA分子标记成为理想的快速鉴定种子纯度的检测方法之一，其中RAPD、RFLP、AFLP、SSR 及ISSR标记等在杂交种纯度鉴定中都有应用。 SSR标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴 定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。目前开发的SSR标记主要有基因组SSR和 EST-SSR两类。相对于基因组SSR，EST-SSR充分利用现有的测序数据，省去了 SSR引物开 发过程中的文库构建和测序等步骤，降低了成本。近年来，随着测序技术的不断提高和分子 生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小 组共收录西瓜ESTs7856条，甜瓜126940条，黄瓜359105条。 EST序列可从世界三大数据库EMBL (欧洲分子生物学实验室)、NCBI (美国国家生 物技术信息中心）以及DDBJ (日本DNA数据库）获取，再利用相关软件即可设计得到SSR引 物。EST序列中SSR的含量较高，而且在种属间具有良好的通用性。冯建明等对西瓜978 条unigene序列分析，共检索出2136个EST-SSR，出现频率为53. 4%，Kong等研究发现甜瓜 EST序列每4. 7kb出现一个SSR，22个EST-SSR引物对平均能揭示2. 9个等位基因，平均期 望杂合度〇. 442,有15对引物能在黄瓜上扩增出条带。关媛等从902条黄瓜果实EST检索 出63个SSR，设计了 37对引物，共有14对引物在黄瓜和甜瓜之间有多态。胡建斌等从来源 于NCBI数据库的6507条ESTs中检索到784个SSR。Kong等利用来源于NCBI的黄瓜EST 序列设计了 54对EST-SSR，分析了 20份黄瓜材料的遗传多样性，其中有13对引物在甜瓜 中扩增出了特异片段，7对引物检测出多态性。EST-SSR在葫芦科瓜类作物中的开发和应用 尚处于起始阶段，由于来源于西瓜、甜瓜和黄瓜中的EST数量有限，造成可以利用的SSR偏 少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种种子纯 度鉴定方法，为实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案： 本方法通过对供试甜瓜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了杂交种 及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种进行纯度鉴定。用于鉴定甜瓜杂交种 种子纯度的SSR引物，包括引物正向序列：5' - GCACGAGGCTCAACTACC -3'，反向引物序列： 5' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3'。 本专利技术所述快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种绿天使 供试种子(天津科润蔬菜研究所）的基因组DNA为模板，对已知品种绿天使亲本DNA差异性 片段进行分析。供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜(来自天津科润蔬菜 研究所）随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50?100 mg,液氮冷冻研磨（Retsch MM400 生物粉碎仪），加入 CTAB 裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1. 4 M NaCl，0· 1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA) 500 μ L，65°C恒温水浴（Neslab)裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组 DNA提纯试剂盒(赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50 ± 1 ng/ μ L，Nanodrop ND1000, Thermol)。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。 供试甜瓜杂交种PCR方法为： (1) SSR上游引物序列： 5, - GCACGAGGCTCAACTACC -3,， SSR 下游引物序列：5' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG-3'。 ⑵采用上述SSR引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增 反应的总体积为1〇μ L，扩增反应体系为：2XGoTaq? Master Mixes 5 μ L，上游和下游引物 10 μ mol/L各0.5 μ L，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板（50 ng/μ L) 1 μ L，双蒸水补足10 μ L ;PCR 反应程序为 95°C预变性 2 min，32 个扩增循环（94°C 45 sec，55°C 45 sec，72°C，45 sec) ;72°C延伸 7min，4°C保存； 供试甜瓜杂交种PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶 组分为：去离子水 21 mL，10XTBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μ L，10% 过流酰胺 300 μ L ; 设定电压250 V，电泳1 h，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8?10 min，迅速水洗，NaOH 显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗； 供试甜瓜杂交种EST-SSR结果分析，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样 品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确 定种子纯度。 为了能更加清楚的说明本专利技术的测定方法，下面对本专利技术的试验方法做以详细的 说明。 、原理： 本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：EST-SSR是以1?6个碱基为重复单 元，是存在于EST中的SSR。EST ( Expressed sequence tag,表达序列标签）是将mRNA在 体外反转录成cDNA并克隆到质粒或噬菌体载体构建cDNA文库后，大规模随机挑取cDNA克 隆，对其5'端或3'端进行测序后获得的长约150?500bp的表达序列片段。EST序列来自 实验室构建的cDNA文库或从美国国家生物信息中心（NCBI)的Genbank中下载。采用相关 软件合成引物，最后对研究材料进行PCR扩增和凝胶电泳，通过特异谱带进行分析，从而计 算杂交种的纯度。 2、 引物设计 通过Gene Bank数据库上公布的214条甜瓜EST序列，利用Primer 3. 0在线引物设计， 引物由上海生工合成，经筛选获得了 1对EST本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于鉴定甜瓜杂交种种子纯度的1对SSR引物，其特征在于包括上游引物序列：5’‑ GCACGAGGCTCAACTACC ‑3’， 下游引物序列： 5’‑ GAGACCGAAATTGAAGAATAG ‑3’。
【技术特征摘要】
1. 用于鉴定甜瓜杂交种种子纯度的1对SSR引物，其特征在于包括上游引物序列：5'_ GCACGAGGCTCAACTACC-3'，下游引物序列：5' -GAGACCGAAATTGAAGAATAG-3'。2. -种采用权利要求1所述引物，基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子鉴定纯度的方 法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 采用权利要求1所述的上游引物序列： 5' -GCACGAGGCTCAACTACC-3'，下游引物序列： 5 ' - GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3 '引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的 PCR扩增反应的总体积为10 UL，扩增反应体系为：2XGoTaq?Master Mixes 5 yL，上游和 下游引物10 μ mol/L各0. 5 μ L，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板，50 ng/ μ L，1 μ L，双蒸水 补足10 μ L ;PCR反应程序...
【专利技术属性】
技术研发人员：张若纬，李欧静，彭冬秀，兰庆阔，武云鹏，王永，李秀秀，
申请(专利权)人：天津科润农业科技股份有限公司，天津市农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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