本发明专利技术公开一种嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。本发明专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列SEQ ID NO：2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶性质有利于纤维素高温同步糖化发酵技术的应用，该酶具有较高酶活和明显作用效果，整个发酵期间纤维二糖保持在底浓度水平，能有效消除终端产物抑制，可以应用于生产燃料乙醇工艺中，表明本发明专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶在能源方面具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于酶基因工程和酶工程领域，具体涉及一种嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。
技术介绍
：β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)属于纤维水解酶类，是一类催化水解或转移β-1,4-糖苷键的酶。是纤维素酶系的重要组成部分,在纤维素酶水解纤维素的过程中，纤维素类物质经酶促作用成葡萄糖至少需要三种酶的协同作用，葡聚糖内切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。葡聚糖内切酶和葡聚糖外切酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖释放葡萄糖是纤维素水解的一个关键限速步骤。但是，β-葡萄糖苷酶在纤维素酶系中含量最低，不足1％，且活性普遍偏低，是纤维素酶解转化的瓶颈。长期以来，酶性质不够优良、酶的产量低及酶的比活力低下一直是影响酶实际应用的重要因素。虽然β-葡萄糖苷酶在微生物中广泛存在，但是真菌、细菌等微生物的产酶效率不高，难以获得大量产品，且热稳定性较差。目前β-葡萄糖苷酶的活力仍不能满足工业生产的需要，而且成本较高。在纤维素糖化过程中，纤维素酶的最适作用温度通常为50℃左右，而酵母发酵的最适温度为30℃左右。如何使这两个过程的温度协调，是采用同步糖化发酵(SSF)高效生产乙醇的关键，解决这种矛盾办法之一就是采用耐高温酵母。因此，对β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达，已成为研究纤维素酶重要环节之一。到目前为止，已有上百个微生物的β-葡萄糖苷酶基因得以克隆，许多微生物来源的β-葡萄糖苷酶基因也已获得异源表达。近年来，国际上通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性、热稳定的β-葡萄糖苷酶研究是纤维素酶学领域研究的热点。关于嗜温β-葡萄糖苷酶及其基因已有的专利和文献报道：Piyanun Harnpicharnchai等报道的Periconia sp.β-葡萄糖苷酶基因片段BCC2871[蛋白质表达与纯化(Protein Expres Purif)67：61–69，2009]；Patrick Murraya等报道嗜热真菌Talaromyces emersonii的β-葡萄糖苷酶基因Cel3a[蛋白质表达与纯化(Protein Expres Purif)38：248–257，2004]；Qiaojuan Yan等报道的Paecilomyces thermophilaβ-葡萄糖苷酶基因PtBglu3[蛋白质表达与纯化(Protein Expres Purif)84：64–72，2012]；Xiao-Qiong Pei等报道的嗜热Thermobifida Fuscaβ-葡萄糖苷酶基因BglC[生物资源技术(Bioresour.Technol.)102：3337–3342，2011]；Linguo Zhao等报道的Thermotoga thermarum DSM5069T高温β－葡萄糖苷酶基因Tt-bgl[分子催化杂志，B辑:酶催化(J Mol Catal B-Enzym)95：62–69，2013]等。微生物产β-葡萄糖苷酶的种类众多，不同来源的β-葡萄糖苷酶具有不同的性质。由于工业上应用的不同，因此需要不断开发出具有新特性的β-葡萄糖苷酶以更好的适应工业生产的需要。其中耐热酶具有很大优越性，可以提高反应速度、延长作用时间，减少污染、增强对化学试剂的耐受性等，以及可以在所需要的特殊条件下进行反应，因此开发嗜温β-葡萄糖苷酶已成为研究热点。我们之前研究中，获得了2株β-葡萄糖苷酶的产生菌：绿色木霉(Trichoderma viride)W2，专利号ZL201010577713.6和肉座菌(Hypocrea sp.)W63，专利号ZL201110417104.9，这2株菌均有嗜温、耐乙醇的特性，其中绿色木霉(Trichoderma viride)W2最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，乙醇浓度为10％(v/v)对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高1.6倍，乙醇耐受能力高达30％(v/v)；肉座菌(Hypocrea sp.)W63最适反应pH值为4.8，最适反应温度为65℃，乙醇浓度为10％(v/v)对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍，乙醇耐受能力高达30％(v/v)。通常情况下，真菌所产的纤维素酶系主要是内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶在纤维素酶系中含量最低，不足1％。利用分子生物学技术构建的基因工程菌具有遗传稳定性高、产酶迅速、产酶量大等优点，生产的重组酶拟满足未来大量工业应用需求。据国内外已有的报道来看，嗜热型β-葡萄糖苷酶基因克隆主要集中来自于嗜热性细菌、真菌，然而这些嗜热型微生物所产的β-葡萄糖苷酶并不一定就具有嗜热及热稳定性能。在产β-葡萄糖苷酶微生物研究中，木霉是研究最早和最广泛的种属之一，但是从肉座菌属克隆的具有嗜温耐乙醇性能的β-葡萄糖苷酶基因尚未见报道。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供一种嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其编码基因。本专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术的编码嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶。所述的编码嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的基因，优选，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。肉座菌(Hypocrea sp.)W63(ZL201110417104.9)生产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶，该酶具有水解4-nitrophenylβ-D-glucopyranoside(pNPG)底物特异性，其最适反应pH值为4.8，最适反应温度为65℃，反应中乙醇浓度为10％(v/v)对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍，乙醇耐受能力高达30％(v/v)。本专利技术从肉座菌(Hypocrea sp.)W63得到的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因epB-BGL，具有2202bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因编码由733个氨基酸组成的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术通过分子生物学方法获得了含有该基因片段的以pPIC9K为表达载体的重组质粒，以毕赤酵母GS115为表达宿主，使重组菌株胞外分泌表达嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶。因此，本专利技术成功通过基因工程或分子生物学手段，将嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶基因克隆到其他受体菌，由其他受体菌产生本专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶。与已知的β-葡萄糖苷酶相比，本专利技术的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶是一种新型的具有新功能的β-葡萄本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嗜温耐乙醇β‑葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种编码权利要求1所述的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的基因。
3.根据权利要求2所述的编码嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，其核苷酸序
列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的编码嗜温耐乙醇β-葡萄糖
苷酶的基因。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁振宏，梁翠谊，许敬亮，陈小燕，庄新姝，张宇，郭颖，周卫征，
申请(专利权)人：中国科学院广州能源研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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