F9基因拷贝数变异检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，包括2×PCR缓冲液；竞争性DNA；PCR引物混合液；Taq DNA聚合酶。AccuCopy技术的精确度高，变异系数小于5%，并且结果的准确性也高。因此，本项发明专利技术采用了AccuCopy技术开发F9基因拷贝数变异检测试剂盒，并检测发现了约15例有大缺失突变的血友病B患者，临床应用效果良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒。
技术介绍
血友病B（HB）是临床常见的一种遗传性出血疾病，主要由F9基因突变导致凝血因子IX（FIX）质或量的缺陷而引起体内凝血功能的异常，在男性中的发病率约为1/30,000。根据血浆中FIX活性，HB可分为轻型（>5%）、中型（1-5%）和重型（<1%）三种类型。重型患者表现为自发性关节出血，肌肉出血和内脏器官出血等，轻型患者表现为外伤后出血难止。因此，该病具有高致残率和致死率。替代治疗是目前唯一有效的治疗方法，制剂主要包括凝血酶原复合物（PCC）和重组凝血因子IX（rFIX)。由于缺乏根治措施，通过携带者诊断和产前诊断避免血友病胎儿的出生，对提高人口素质，减轻社会负担具有重要的意义。然而，前提是需要先对家系中血友病B患者进行准确有效的基因诊断。F9基因位于X染色体长臂27.1-27.2，全长32.7kb，包括8个外显子和7个内含子及其侧翼调控区域。遗传方式为X连锁隐性遗传病，先证者同胞患病风险决定于母亲是否为致病基因携带者，携带者女性的男性后代患病风险为50%，女性后代携带致病基因的风险也为50%。男性患者的女性后代100%为携带者，而男性后代100%为正常。目前已报道的F9基因突变类型广泛，包括有点突变、缺失、插入、重复等。随着基因体外扩增技术的出现和发展，通过患者外周血有核细胞DNA进行F9基因分析已经成为当前进行F9基因诊断的主要手段。简单来说，针对F9的8个外显子及其侧翼序列区域分别设计PCR引物进行体外扩增，然后将PCR扩增产物进行直接测序，通过将测序结果与参考序列比对，查找可能的致病突变。这种直接测序的方法可以检测错义突变、剪接位点突变、无义突变及小缺失和小插入等突变。当家系中先证者的突变位点明确后，对于女性家系成员进行的携带者检测只需扩增相应突变位点所在的外显子，测序比对是否存在相同的突变。如果该女性为携带者，那么相应位点为杂合突变。女性携带者怀孕后，为了避免患儿的出生，怀孕16-22周时需要抽取胎儿羊水进行DNA抽提，直接扩增胎儿羊水DNA的相应突变位点所在外显子，测序比对后查找胎儿是否存在相同的突变。除了直接测序法查找致病突变外，我们还会对家系成员进行基因连锁分析，以对携带者检测和产前诊断结果进行核实。基因连锁分析并不是直接检测致病基因的异常，而是利用与致病基因紧密连锁和共同传递的一系列基因组遗传多态性标记，通过检测家系先证者，明确与致病基因相关的这些遗传标记的特点，进而对家系中其他成员的遗传标记进行检测协助诊断。经过前期工作的筛选后，我们选择了F9 基因外的6个STR位点（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102）用于F9基因的遗传连锁分析。然而由于遗传连锁分析属于间诊断方法，且容易受到染色体同源重组等因素的影响，不能得到完全可靠的结果，所以需要与常规测序方法的结果相互验证以取得更加可信的诊断结论。利用常规直接测序方法可使绝大部分的血友病B家系能得到明确诊断。但据血友病B突变数据库统计，大缺失或重复突变占总F9基因突变类型的5%左右，直接测序的方法不能给与明确诊断，甚至漏诊。首先，当先证者存在大片段缺失时，由于缺失而使得PCR扩增失败。而对于女性家系成员来说，由于存在另外一条正常的染色体模板，PCR扩增是能够成功的，测序结果也是正常的，但不能排除携带者的可能性。其次，当先证者为大片段重复时，PCR能够成功扩增所有外显子区域，但是测序比对不能发现重复突变。此时，对相应外显子的拷贝数进行定量能够明确。基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异（CNVs）。随着微阵列CNV芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，发现拷贝数变异（CNVs）广泛地存在于人类染色体基因组中。CNVs主要由基因组发生重组而导致，一般指长度为几kb-几Mb基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入等。通过拷贝数检测方法对先证者F9各外显子的拷贝数进行检测，如果相应外显子缺失，则拷贝数结果为0；如果相应外显子重复，则拷贝数结果大于1。而对于携带者来说，如果缺失拷贝数结果为1，而重复的话拷贝数结果将大于2。但是目前针对CNVs的检测方法非常多，选择合适的技术用于F9基因检测极为重要。目前CNVs的检测方法主要有：多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-depengent probe amplification，MLPA)、微阵列比较基因杂交(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型芯片、affymetrix CNV芯片技术及二代测序技术等。此外，实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)等则主要用于CNVs的验证。其中array-CGH、SNP分型芯片、Affymetrix微阵列技术、二代测序技术等主要用于全基因组范围内未知CNVs的检测，这些全基因组CNVs检测技术先进，准确而高效，但相对比较昂贵，尤其是在检测某些特定基因或者特定区域时并不是最佳选择。RT-qPCR方法虽然经典，但是效率太低，一个反应体系中不能同时对多个片段进行检测。MLPA主要是针对特定基因或特定区域进行拷贝数检测的技术，2002年由Schouten等首次报道，是目前应用最为广泛的单一基因拷贝数检测技术，可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测，所需设施简单，PCR仪和毛细管电泳仪。荷兰MRC-Holland公司研发了数百种MLPA检测试剂盒，用于人类疾病，细胞遗传学及肿瘤研究，其中包括各种遗传性出血与血栓性疾病的相关基因的CNVs的检测。尽管MLPA在诊断特定基因外显子CNVs方面技术已经非常成熟，但是MLPA也存在一些比较突出的问题。首先，它对所检测标本的DNA质量要求相对较高，普通的DNA抽提方法无法满足实验要求，需要购买质量较好的商品化试剂盒进行抽提，增加了实验成本，而且检测标本和参比标本必须使用同种DNA抽提方法。其次，MLPA方法不易建立，我们也曾试图进行该方法的建立，但是通过多次尝试后，并未得到理想而又准确的结果。我们也曾经购买商品化的试剂盒，每次检测结果不稳定，不能保证结果的可靠性。因此，我们针对自己的需求开发了以多重荧光竞争PCR技术为基础的AccuCopy拷贝数检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，基于多重基因拷贝数检测方法技术，检测F9基因拷贝数变异的试剂盒及检测体系，主要用于检测F9基因缺失或重复突变而导致的凝血因子IX（FIX）质或量的缺陷，以获取F9基因各目标位点的正确拷贝数的检测试剂盒。为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：1）2×PCR缓冲液；2）竞争性DNA；3）PCR引物混合液；4）Taq DNA聚合酶；其中，所述PCR引物混合液包括：a）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七对目标位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:1‑14；b）参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15‑20；c）一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:21‑22；所述竞争性DNA包括：i）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七个人标准序列的内对照DNA：SEQ ID NO:23‑29;ii）参照基因A、参照基因B、参照基因C共三个参照基因的内对照DNA：SEQ ID NO:30‑32。

【技术特征摘要】
1.一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：
1）2×PCR缓冲液；
2）竞争性DNA；
3）PCR引物混合液；
4）Taq DNA聚合酶；
其中，所述PCR引物混合液包括：
a）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9_7，F9_8共七对目标位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:1-14；
b）参照位点A、参照位点B、参照位点C共三对参照基因的多重PCR引物：SEQ ID NO:15-20；
c）一对性别位点的多重PCR引物：SEQ ID NO:21-22；
所述竞争性DNA包括：
i）F9_1，F9_2+3，F9_4，F9_5，F9_6，F9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学锋，姜正文，丁秋兰，张希，戴菁，姚忻岑，陆晔玲，林琳，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，天昊生物医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31