本发明专利技术提供了一种用红豆杉愈伤组织产生紫杉醇的方法，以‘曼地亚’红豆杉叶片为外植体，经消毒、灭菌、接种，培养一段时间后，在叶片伤口处产生愈伤组织，继续对愈伤组织进行增殖培养。取红豆杉叶片愈伤组织研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，收集有机相，过滤后用旋转蒸发器减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明专利技术应用组织培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、蔗糖等成分；为进行工厂化细胞生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种用红豆杉愈伤组织产生紫杉醇的方法，以‘曼地亚’红豆杉叶片为外植体，经消毒、灭菌、接种，培养一段时间后，在叶片伤口处产生愈伤组织，继续对愈伤组织进行增殖培养。取红豆杉叶片愈伤组织研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，收集有机相，过滤后用旋转蒸发器减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本专利技术应用组织培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题。所用基本培养基以SH培养基为基础，辅以2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、蔗糖等成分；为进行工厂化细胞生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。【专利说明】
本专利技术涉及紫杉醇的产生，特别是一种通过红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方 法。
技术介绍
紫杉醇（Taxol)，化学式为C47H51N014,分子量是853.92,白色结晶体粉末，无臭，无 味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，熔点213?216°C。化学名称：5β，20-环 氧-1，2〇,4,7 0，1〇0，13〇-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，1〇-二乙酸酯-2-苯甲酸 酯-13。是从红豆杉属（^31118 8卩卩.）植 物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，具有很高的开发利用价值，是经 美国国家食品与药品管理中心正式批准（1992. 12)的，目前世界主流的抗癌药物之一。开 始，紫杉醇为晚期卵巢癌的治疗药物。随后又批准用于治疗乳腺癌。目前紫杉醇是最好的 治疗卵巢癌和乳腺癌的药物，价格非常昂贵，市场售价为4800美元/克。至今为止，紫杉醇 已经被成功地广泛应用于对包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤在内的多种恶性肿瘤的 治疗。而且紫杉醇对其它肿瘤的疗效正在被进一步研究，测试证明它对其它的多种肿瘤也 有潜在的疗效。 目前，生产紫杉醇原料药有以下几种途径：①直接从红豆杉树皮或整株红豆杉 植株中提取；但是含有紫杉醇的自然资源一红豆杉和东非罗汉松（1999年测知含紫杉 醇)-一都生长地十分缓慢，数量有限且其中有效成分的含量非常低。最初，用于治疗的紫杉 醇都来源于太平洋红豆杉，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆杉。②半合成法，即先从 红豆杉中提取前体(体包括10-脱酰基巴卡丁 III、巴卡丁 III，10-脱酰基紫杉醇，10-脱酰 基三尖杉宁碱，7-戊醛基-10-脱酰基紫杉醇等)，前体再进行化学半合成制得紫杉醇成品； 在一定的程度上，这缓和了药源紧张的问题，但由于野生红豆杉资源濒危，原料仍然受到制 约。③全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产；④生物反应器法：培养寄生在红豆 杉树木身上的某些真菌来获取紫杉醇。⑤培养能产生紫杉醇的红豆杉细胞来生产紫杉醇。 其中培养红豆杉内生真菌和红豆杉细胞法生产紫杉醇属于"环境友好型"工艺，对环境无污 染，利用来源丰富的淀粉类原料，属于绿色农产品原料。科学家普遍认为，真菌生物反应器 法和红豆杉细胞法生产紫杉醇代表着紫杉醇生产的未来方向。
技术实现思路
针对紫杉醇原料药市场缺口较大的问题，本专利技术目的是提供一种通过红豆杉叶片 愈伤组织产生紫杉醇的方法。 本专利技术的技术方案是： ，以红豆杉叶片为外植体，经灭菌、接 种、诱导红豆杉叶片愈伤组织，再培养红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤如下： Α、外植体的选择和灭菌处理：以'曼地亚'红豆杉（Taxus media)叶片为外植体，以2% 洗洁精浸泡，摇床120-180转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度 为0. 1%的氯化汞中，浸泡灭菌8-15分钟，无菌水冲洗7-8次，备用； B、 外植体接种：将经过步骤A中准备的外植体叶片，接种在含有所用基本培养基以SH 培养基为基础，添加了 2,4-D、L-脯氨酸的培养基中； C、 愈伤组织的诱导：将经过步骤B中得到的外植体叶片，培养于2,4-D 3. 0-5. Omg/L、 L_脯氨酸300-500 mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7. 5g/L，ρΗ5· 85-5. 95,至 出现红豆杉叶片愈伤组织； D、 愈伤组织培养：将步骤C中得到的红豆杉叶片愈伤组织接种于SH+2,4-Dl. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21±2 °C，光照强度为 1000-1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为10-15天。培养10-15天后检测愈伤组织 中紫杉醇含量； E、 紫杉醇提取：将步骤D中的愈伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处 理时间为25-35min，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋 蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，0. 45 μ m滤膜过滤。，定容至10mL备用； F、 紫杉醇提取含量检测：经HPLC检测，真菌产生的愈伤组织中含有紫杉醇，平均含量 为 3. 24mg/L。 前面所述的方法，优选的方案在于：所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物'曼地 亚，红豆杉（Taxus media)。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤A、外植体的选择和灭菌处理时：以2%洗 洁精浸泡，摇床120-180转摇15-20分钟，用清水冲洗时间为15-30分钟，浸泡灭菌时间为 8-15分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤B、C外植体接种时：培养基为SH+2,4_D 3. 0-5. Omg/L+ L-脯氨酸300-500 mg/L。愈伤组织的诱导时：培养温度为21 ±2°C，光照强 度为1000-1600Lux，光照时间为14小时，诱导时间为3-10天。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤D时，培养基为：SH+2,4-Dl. 0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，培养温度为21 ±2°C，光照强度为1600Lux，光照时间 为10-14小时，培养时间为10-15天。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤E、紫杉醇提取：超声处理时间为 25-35min，滤膜过滤时用0. 45 μ m滤膜。 前面所述的方法，优选的方案在于：步骤F、紫杉醇提取含量检测：色谱条件为： C18 柱：250_X46mm ;流动相，甲醇：水（v/v)=60 :40 ;压力：1506PSI=10. 39MPa ;保护压力： 100L0-Pr ;流速 0. 7mL/ min，检测波长 228nm，灵敏度，(λ lAUf' s，柱温 35°C。 本专利技术提供的是，以'曼地亚' 红豆杉叶片为材料，经75%酒精杀毒，0. 1%氯化汞灭菌处理，置于含有2,4-D3. 0-5. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基中，待愈伤组织诱导出来以后继代于2,4-D1. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培养基的SH培养基中。培养15天后，进行紫杉醇提取。将愈 伤组织用液氮研磨并用乙酸乙酯超声萃取3次，超声处理时间为25-35min，收集有机相，力口 入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法，其特征在于：以红豆杉叶片为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉叶片愈伤组织，再培养红豆杉叶片愈伤组织产生紫杉醇的方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：穆红梅，杜秀菊，曹贵玲，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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