新型RNAi前体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了高效引发RNAi的新型RNAi前体分子及其制备方法和应用。所述RNAi前体从5′端到3′端依次为：长1nt的5′端未配对区域；长15nt-17nt的5′端配对区域；长3nt-9nt的顶端环区域；长15nt-17nt的3′端配对区域，所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域；长1nt-6nt的3′端未配对区域；以及任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，所述RNAi前体产生的siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。本发明专利技术RNAi前体加工生成单链siRNA的效率显著提高，对靶基因的抑制效率更高；脱靶作用更弱；毒性低。

【技术实现步骤摘要】
新型RNAi前体及其制备和应用
本专利技术涉及生物
具体地说，本专利技术涉及新型的RNAi前体及其制备和应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是真核生物中由双链小RNA分子(smallinterferingRNA，siRNA)介导的RNA降解现象，最初在秀丽线虫中被发现，此后发现RNAi现象在果蝇、拟南芥、斑马鱼和哺乳动物等多种真核生物中都是高度保守的。由于RNAi可以被用来特异性关闭靶基因的表达，具有极大的应用价值。因此，自1998年被发现以来，RNAi多次入选Science杂志评出的年度十大科学进展，并名列2002年十大科学进展之首。2006年，CraigMello和AndrewFire因发现RNAi现象而被授予诺贝尔生理医学奖。目前大量生物技术公司和国际大制药企业投资进入RNAi技术开发和应用领域，其中针对呼吸道合胞体病毒感染(Respiratorysyncytialvirusinfection)以及湿性年龄相关性黄斑变性病症(Wetage-relatedmaculardegeneration)等几种疾病的RNAi治疗已进入二期和三期临床试验。另外针对乙型肝炎(HepatitisB)、实体瘤(solidtumors)以及先天性厚甲症(Pachyonychiacongenita)等疾病的RNAi药物也已进入一期或二期临床试验。RNAi中的关键功能分子是长度约为21个核苷酸的siRNA，最初应用时主要依靠化学方法合成，这种方法获得的siRNA虽然能有效抑制目的基因的表达，但容易被细胞代谢清除，作用持续时间较短，且合成成本较高，每毫克siRNA的化学合成成本需要上千元。为了长期稳定表达siRNA，研究人员设计开发出了由细胞内自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNApolymeraseⅢ)启动子，如H1，U6等转录产生的shRNA(shorthairpinRNA)。shRNA被细胞内的核酸酶Dicer进一步加工后产生成熟的siRNA，发挥沉默靶基因表达的效果。这种基于RNA聚合酶Ⅲ的shRNA表达载体转录效率高，且能在大多数种类的组织细胞中表达。构建成病毒载体，比如慢病毒和腺病毒载体等后，可以用于感染原代细胞等用普通方法难以转染的细胞，从而达到沉默靶基因的目的。因此，shRNA载体技术得到广泛应用，有多个公司开发了相应的shRNA载体用于商业化应用，这是通常所说的第一代RNAi载体技术。RNAi已经成为大多数生物和医学实验室日常都需要使用的技术，但目前使用的shRNA载体由于其自身特点而在实际应用时存在一些缺点，主要包括：(1)效率不高。往往需要设计5个shRNA或siRNA才能保证有1-2个能对靶基因达到70％以上的抑制效果。(2)脱靶作用(off-target)严重。由于siRNA可以通过与mRNA部分互补配对(类似miRNA的作用方式)，从而非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。这种作用方式不只局限于Ago2蛋白，其它不具有切割活性的Argonaute蛋白，例如哺乳动物中的Ago1、3、4，也可以引起脱靶作用，并且siRNA中除了发挥功能的guidestrand(引导链)以外，另一条互补链(称为passengerstrand，过客链)也会产生脱靶作用。(3)对细胞内源miRNA具有较强的非特异性竞争作用。由于siRNA在加工成熟以及行使功能时，需要利用参与miRNA途径的蛋白因子，比如Dicer，exportin-5以及Ago2等，所以必然会对内源的miRNA产生竞争，影响内源miRNA的正常加工和功能。研究表明，长期高表达shRNA会对成年小鼠肝脏造成损伤并致死【1】。综上所述，本领域急需毒副作用低，对靶基因的抑制效率高以及产生成熟siRNA效率高的RNAi载体，从而更好地应用于科学研究和疾病治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以引发RNA干扰（RNAi）的新型RNAi前体分子（saRNA，Single-strandedAgo2-processedinterferingRNA）及其制备方法和应用，所述RNAi前体对靶基因的抑制效率更高、脱靶作用更弱、毒性低，因此在研究基因功能和基因治疗等方面具有极大潜力。在第一方面，本专利技术提供一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端未配对区域，所述5′端未配对区域长度为1nt；(b)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度为15nt-17nt；(c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt-9nt；(d)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；(e)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；以及(f)任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，其中，所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述siRNA的核苷酸序列位于所述双链区域和顶端环区域的第1到第22位之间。在优选的实施方式中，所述siRNA的长度为22nt-30nt。在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt-6nt。在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。在另一优选的实施方式中，所述RNAi前体包含与3′端未配对区域相连的3′端核酶区。在另一优选的实施方式中，所述核酶选自：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶等；优选地，所述核酶是HDV核酶。在优选的实施方式中，所述RNAi前体由Ago2选择性加工产生成熟的siRNA。在优选的实施方式中，所述RNAi前体是化学合成的。在第二方面，本专利技术提供一种表达盒，所述表达盒包含本专利技术第一方面所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生本专利技术第一方面所述的RNAi前体。在第三方面，本专利技术提供一种构建物，所述构建物包含本专利技术第二方面所述的表达盒。在第四方面，本专利技术提供一种细胞，所述细胞包含本专利技术第一方面所述的RNAi前体或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物。在第四方面，本专利技术提供一种产生siRNA的方法，所述方法包括：1)将本专利技术第一方面所述的RNAi前体或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞；和2)培养所述哺乳动物细胞，从而在所述哺乳动物细胞中产生siRNA。在优选的实施方式中，所述方法还包括从所述哺乳动物细胞中得到产生的siRNA。在优选的实施方式中，所述方法在体外、为非治疗目的而实施。在第五方面，本专利技术提供一种在哺乳动物细胞中实施RNAi的方法，所述方法包括：将本专利技术第一方面所述的RNAi前体或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物转入哺乳动物细胞。在第六方面，本专利技术提供一种组合或组合物，所述组合或组合物包含：1)本专利技术第一方面所述的RNAi前体或本专利技术第二方面所述的表达盒或本专利技术第三方面所述的构建物；和2)适合将1)所述的RNAi前体或表达盒或构建物导入哺乳动物细胞的其它试剂；所述组合或组合物在导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端未配对区域，所述5′端未配对区域长度为1nt；(b)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度为15nt‑17nt；(c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt‑9nt；(d)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度为15nt‑17nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp‑17bp；(e)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为1nt‑6nt；以及(f)任选的与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，其中，所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种RNAi前体，所述RNAi前体的核苷酸序列从5′端到3′端依次具有以下区域：(a)5′端未配对区域，所述5′端未配对区域长度为1nt；(b)5′端配对区域，所述5′端配对区域长度为15nt-17nt；(c)顶端环区域，所述顶端环区域长度为3nt-9nt；(d)3′端配对区域，所述3′端配对区域长度为15nt-17nt，并且所述5′端配对区域与3′端配对区域形成双链区域，所述双链区域长度为15bp-17bp；(e)3′端未配对区域，所述3′端未配对区域长度为1nt-6nt；以及(f)与3′端未配对区域相连的3′端核酶区，其中，所述RNAi前体可产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述5′端配对区域和顶端环区域的核苷酸序列；所述核酶是自剪切核酶。2.如权利要求1所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt-6nt。3.如权利要求2所述的RNAi前体，其特征在于，所述RNAi前体中顶端环长度为4nt。4.如权利要求1-3中任一项所述的RNAi前体，其特征在于，所述自剪切核酶选自：HDV核酶、发夹状核酶、锤头状核酶。5.如权利要求4所述的RNAi前体，其特征在于，所述核酶是HDV核酶。6.一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号，所述表达盒在转录后产生权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体。7.一种构建物，所述构建物包含权利要求6所述的表达盒。8.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-5中任一项所述的RNAi前体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的构建物。9.一种产生siRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴立刚，尚仁福，徐蓓英，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31