本发明专利技术公开了一种重组转座载体PXL-BACⅡ-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，包括以下步骤：1)设计家蚕Hedgehog基因扩增引物；2)克隆Hedgehog基因：以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA；反转录合成得到cDNA；再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18-T载体上，测序确认；3)构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BACⅡ-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor。本发明专利技术采用RT-PCR方法合成家蚕Hedgehog基因，测序后构建转座载体，并通过转座载体插入家蚕细胞的基因组，获得Hedgehog信号传导通路过表达的转基因家蚕细胞系，用于研究Hedgehog基因功能。
【技术实现步骤摘要】
Hedgehog信号通路过表达转基因家奋细胞系及所用重组转座载体
本专利技术涉及一种用于Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因家蚕细胞系的构建。具体地讲，本专利技术采用RT-PCR方法合成家蚕Hedgehog基因，测序后构建转座载体，并通过转座载体插入家蚕细胞的基因组，获得Hedgehog信号传导通路过表达的转基因家蚕细胞系，用于研究Hedgehog基因功能。
技术介绍
从脊椎动物到无脊椎动物，Hh信号通路广泛存在并高度保守，在动物胚胎多种组织器官的发育中发挥重要作用。Hh以及它下游信号分子的变异与多种癌症等疾病的发生有关。因此，研究Hh信号通路的转导机制对于了解动物体的生长发育机制以及某些疾病的发生都有着重要意义。Hh信号通路包括具有信号传递活性的分泌型信号糖蛋白Hh、12次跨膜蛋白受体Patched(Ptch)、7次跨膜效应蛋白Smoothened(Smo)和下游可入核参与信号转导的锌指转录因子C1、微管驱动蛋白Costal2 (Cos2),丝氨酸/苏氨酸激酶Fused(Fu)等。家蚕不仅是重要的经济昆虫，而且也是鳞翅目昆虫的典型模式生物，同时也是开发新一代生物反应器的重要材料。脂肪体是家蚕体内重要的组织器官，具有类似哺乳动物肝脏和肾脏的功能， 它既是糖类、脂类和蛋白质等物质的合成和代谢中心，还具有贮存营养、解毒以及为生命周期活动提供各种生物合成的代谢产物等生理功能。脂肪体内贮存物质丰富与否与幼虫生长发育及变态、成虫产卵量和卵质量好坏都有密切关系。构建Hedgehog信号传导通路过表达转基因细胞系，研究其Hh信号通路对于家蚕脂肪细胞分化发育的调控作用，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供构建Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因细胞系，研究其Hh信号通路对于家蚕脂肪细胞分化发育的调控作用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，包括以下步骤:I)、设计家蚕Hedgehog基因扩增引物；2)、克隆 Hedgehog 基因:以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认；3)、构建 Hh 基因过表达重组转座载体 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0作为本专利技术的重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法的改进，包括以下步骤:①、利用家蚕基因组数据库(http://silkworm.genomics.0rg.cn/)和NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的 EST 数据库设计家香 Hedgehog 基因扩增引物(在上下游引物两端加上BamHI和EcoRI酶切位点)；②、以纯种P50家蚕为材料，取50_100mg家蚕组织，提取总RNA进行反转录，合成cDNA ；以上述合成的cDNA为模板，并以上述步骤①设计并合成的引物，进行PCR扩增；③、以回收纯化试剂盒将上述Hedgehog基因目的片段进行回收，直接连接到PMD18-T载体上，转染大肠杆菌感受态细胞DH5 α，取100 μ I质粒菌液进行测序、确认序列；克隆获得的Hedgehog基因目的片段长度为834bp ；④、取PXL-BAC I1-ZsGFP_BmU6 和 pMD18T_Hh 载体分别用 BamHI 和 EcoRI 这两种限制性内切酶进行双酶切反应；将回收所得产物采用T4连接酶，16°C连接过夜；连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养单菌落，并提取质粒进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 载体；⑤、用EcoRI酶切PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6_Hh，酶切产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，并将与预期大小(约7000bp)相符的目的片段进行回收；将 ie-NecZ-poly (A)EcoRI 酶切回收产物克隆到上述 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 的EcoRI酶切回收产物中，经过转化感受态，培养单菌落并鉴定后，得到重组转座质粒PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor0备注说明:重组 转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmUe-Hh-Nec/用于Hedgehog信号传导通路过表达研究。作为本专利技术的重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法的改进:家蚕Hedgehog基因扩增引物为:Hh-cDNA-F: cgcggatccgcgATGAACCAGTGGCCGGGAGTHh-cDNA-R:cggaattccgTCGATATCTATACGATGCTGo本专利技术还同时提供了一种用于Hedgehog信号传导通路过表达研究的转基因家蚕细胞系的构建方法，包括以下步骤:I)将重组转座载体 PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor 质粒和 Helper 质粒按照 1:1的质量比混匀，采用转染试剂lipofectamineTM2000转染家蚕细胞BmN，转染24小时后观察荧光蛋白的表达情况；2)通过不同浓度的G418筛选培养基确定BmN对G418的敏感度，从而确定BmN细胞最佳筛选浓度为800 μ g/mL ；3)将重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor转染BmN细胞，培养24小时后加入药物新霉素类似物G418(试验确定最佳筛选浓度800 μ g/ml),连续筛选一个月后可以看到阴性细胞已全部死亡，视野中全部为发出绿色荧光的阳性细胞；所得到的转基因细胞系既有抗G418能力，又能表达绿色荧光蛋白。本专利技术还同时公开了转基因细胞系中Hh信号通路及其靶基因AP2的表达情况，SPHedgehog基因功能分析,包括以下步骤:I)、在上述转基因家蚕细胞系中，Hh基因的表达水平极高，Smo, Ci和Fu的表达水平也随之升高，但是Ptch和Cos2的表达水平反而降低，这说明了在转基因细胞系中Hh基因得到极其有效的过表达，从而使Hh信号通路激活，SmoXi和Fu是Hh信号通路的正调控因子，表达激活，表达量增加，而PtCh和Cos2作为Hh信号通路的负调控因子，在此时表达受到抑制，表达量降低；2)、在上述转基因家蚕细胞系中，AP2基因的表达量也有明显降低，因为AP2是脂肪标记蛋白，脂质伴侣，因此Hh信号通路抑制脂肪形成。综上所述，本专利技术主要
技术实现思路
包括以下步骤:1)设计家蚕Hedgehog基因扩增引物。2)克隆Hedgehog基因。以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认。3)构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor04)重组转座载体转染家蚕BmN细胞。上述重组转座载体PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh_Neor 用 I ipofectamine?2000R本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组转座载体PXL‑BACⅡ‑ZsGFP‑BmU6‑Hh‑Neor的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)、设计家蚕Hedgehog基因扩增引物；2)、克隆Hedgehog基因：以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA；反转录合成得到cDNA；再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18‑T载体上，测序确认；3)、构建Hh基因过表达重组转座载体PXL‑BACⅡ‑ZsGFP‑BmU6‑Hh‑Neor。
【技术特征摘要】
1.重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)、设计家蚕Hedgehog基因扩增引物； 2)、克隆Hedgehog基因: 以纯种P50家蚕为材料，提取总RNA ;反转录合成得到cDNA ;再以此cDNA为模板，PCR合成Hedgehog基因；PCR产物直接连接到pMD18_T载体上，测序确认； 3)、构建Hh基因过表达重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh-Neor02.根据权利要求1所述的重组转座载体PXL-BACI1-ZsGFP-BmUe-Hh-Neolr的构建方法，其特征在于包括以下步骤: ①、利用家蚕基因组数据库和NCBI的EST数据库设计家蚕Hedgehog基因扩增引物； ②、以纯种P50家蚕为材料，取50-100mg家蚕组织，提取总RNA进行反转录，合成cDNA；以上述合成的cDNA为模板，并以上述步骤①设计并合成的引物，进行PCR扩增； ③、以回收纯化试剂盒将上述Hedgehog基因目的片段进行回收，直接连接到PMD18-T载体上，转染大肠杆菌感受态细胞DH5a，取100 μ I质粒菌液进行测序、确认序列；克隆获得的Hedgehog基因目的片段长度为834bp ； ④、取PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6 和 pMD18T_Hh 载体分别用 BamHI 和 EcoRI 这两种限制性内切酶进行双酶切反应；将回收所得产物采用T4连接酶，16°C连接过夜；连接产物转化DH5 α感受态细胞，培养单菌落，并提取质粒进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh 载体； ⑤、用EcoRI酶切PXL-BACI1-ZsGFP-BmU6-Hh，酶切产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带，并将与预期大小相符的目的片段进行回收；将ie-NecZ-poly (A)EcoRI酶切回收产物克隆到上述PXL-BAC I1-ZsGFP-BmU6-Hh的EcoRI酶切回收产物中，经过转化感...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪云根，梁爽，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。