本发明专利技术涉及在搅拌和通气的生物反应器中使用属于丝状真菌的菌株生产纤维素酶和半纤维素酶的方法，其包括至少两个阶段：用于在封闭反应器中在至少一种碳质生长底物存在的情况下使所述菌株生长的阶段a)，所述生长阶段以10-90g/L范围的碳质生长底物浓度实施；用于连续生产纤维素酶的阶段b)，其中在至少超过200h的期间内以恒定的供给速率供给至少一种碳质诱导物底物，所述碳质底物是从木质纤维素底物的酸预处理获得的至少一种半纤维素水解物水溶液，所述半纤维素水解物水溶液不进行预先灭菌也不进行pH校正，所述水溶液的pH范围为0.5-3，反应体积量通过取出一部分所述反应体积而保持恒定，所述阶段b)以范围为0.001-0.02h-1的稀释速率进行操作。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及生产纤维素酶和半纤维素酶，特别是在从木质纤维素材料生产乙醇的背景下生产纤维素酶和半纤维素酶。特别地，本专利技术涉及从丝状真菌开始连续生产纤维素酶的方法。现有技术开发用于生产第二代生物燃料的经济上可行的方法目前是一个“热点”。这些燃料从木质纤维素生物量生产，并且与从甘蔗、玉米、小麦或甜菜生产的“第一代”生物燃料相t匕，在关于与用于食物的农业用地的使用竞争方面产生更少的问题。木质纤维素生物量的特征在于由三个主要级分组成的复杂结构:纤维素、半纤维素和木质素。将其转化成乙醇的常规方法包括一些步骤。预处理可以使纤维素能与酶，即纤维素酶接触。酶水解步骤可以用于将纤维素转化成葡萄糖，其然后在发酵步骤过程中转化成乙醇，所述发酵通常使用酵母酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)。最后,蒸懼步骤可以从发酵液(fermentation must)中分离并回收乙醇。各种技术-经济的研究已证明，减少纤维素酶的成本是在从木质纤维素物质开始的生物乙醇生产方法中的关键点之一。目前，工业纤维素酶主要是由丝状真菌，里氏木霉(Trichodernia reesei)生产，因为其具有高纤维素酶分泌能力。 里氏木霉是最广泛用于生产纤维素酶的微生物。野生型菌株具有分泌纤维素(例如，在诱导物底物存在的情况下)的能力，考虑中的酶鸡尾酒(cocktail)对于纤维素的水解是最合适的。酶鸡尾酒的酶类包含三种主要活性类型:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶。具有对木质纤维素材料的水解至关重要的性质的其它蛋白也由里氏木霉产生，例如木聚糖酶。诱导物底物的存在对纤维素分解和/或半纤维素分解酶的表达是至关重要的。对针对各种碳源的纤维素酶基因的调控已经进行了详细研究。它们在纤维素、其水解产物(例如:纤维二糖)或某些低聚糖，诸如乳糖或槐糖存在的情况下被诱导(ΙΙπι?η等人，1997; Appl Environ Microbiol 63: 1298-1306)。常规突变基因技术已经能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，诸如株MCG77 (Gallo -专利 US 4 275 167)、MCG80 (Allen, A.L.和 Andreotti, R.E.，Biotechnol-Bioengi 1982，12，451-459 1982)、RUT C30 (Montenecourt, B.S.和 Eveleigh, D.E.,Appl Environ Microbiol 1977, 34, 777-782)和 CL847 (Durand 等人，1984，ProcColloque SFM ^Genetique des microorganismes industriels〃 [Genetics of industrialmicroorganisms].Paris.H.HESLOT Ed, pp 39-50)。从工业规模放大的观点来看，里氏木霉生产纤维素酶的方法已经是非常多的改进的目标。工业上采用的策略是在被称为真菌的生长阶段的步骤中使所述真菌快速生长至给定浓度，然后从所述真菌开始诱导生产纤维素酶，以便在被称为生产阶段的步骤中最大限度地提高生产率和产率。所述生长阶段通常在封闭的反应器中(即，以分批模式)实施。所述生产阶段通常在连续补料的反应器中实施，该期间不从反应器内容物中取出任何物质，即，它是分批补料模式。为了获得良好的酶的生产率，有必要提供可以被快速吸收用于里氏木霉在生长阶段生长的碳源，和在生产阶段允许纤维素酶表达并在培养基中分泌的诱导物底物。纤维素可以起双重作用；然而，它在工业规模上难以使用，并已经被可用于表达纤维素酶的可溶性碳源诸如乳糖所替代。也已经描述了作为诱导物底物的其它可溶性糖诸如纤维二糖或槐糖，但是它们太昂贵而不能在工业规模上使用。然而，里氏木霉使用可溶性底物的纤维素酶生产远不如以分批模式基于纤维素所获得的生产率。这是由于糖的阻遏作用在高浓度可以很容易被吸收。在分批补料模式中连续供给可溶性碳质诱导物底物意味着，通过限制培养物中的碳质底物的残留浓度并通过优化糖的数量已经能够解除代谢阻遏，以便获得更好的产率和更好的酶生产率。作为实例，专利FR-B-2 881 753描述了生产纤维素酶的方法，包括两个步骤: ?“分批”模式的生长阶段，其中供给可快速吸收用于里氏木酶生长的碳源是必需的，然后 ? “分批补料”生产阶段，使用诱导物底物诸如乳糖，例如，其允许纤维素酶的表达和分泌到培养基中。以特定优化的流速连续供给可溶性碳质底物，所述流速以mg底物每克丝状真菌的干重每小时表示，范围为35至45 mg.g' h'在该专利中，蛋白生产步骤的实施不多于约170 h。该方案意味着可以获得35-40g/L量级的蛋白浓度和0.2 g/L/h量级的生产率。然而，反应器必须进行清洁，且必须实施新的接种顺序。该操作方式的缺点是生产率太低，这意味着，酶生产发酵罐的数量的初始投资必须增加。获得的蛋白浓度也低，而且经常在过滤菌丝体后需要浓缩步骤。所有这些都促使第二代乙醇生产方法缺乏竞争力。本专利技术的一个目的是提供使用从木质纤维素底物的酸预处理获得的至少一种特定碳质诱导物底物生产纤维素酶和半纤维素酶，以便与现有技术方法相比增加或甚至加倍增加生产的纤维素酶和半纤维素酶的生产率和浓度,并且在增加期间内连续生产这些纤维素酶的方法。本专利技术的方法可以用来增加或者甚至加倍增加生产的纤维素酶和半纤维素酶的生产率和浓度，同时与现有技术方法中使用的碳质底物相比使纤维素酶的生产产率保持恒定。专利技术概述和优点 本专利技术涉及在搅拌和通气的生物反应器中使用丝状真菌菌株生产纤维素酶和半纤维素酶的方法，其包括至少两个阶段: ?用于在封闭反应器中在至少一种碳质生长底物存在的情况下使所述菌株生长的阶段a)，所述生长阶段以范围为10-90 g/L的碳质生长底物浓度实施； ?用于连续生产纤维素酶的阶段b)，其中在至少多于200h的期间内以恒定的供给速率供给至少一种碳质诱导物底物，所述碳质诱导物底物是从木质纤维素底物的酸预处理获得的至少一种半纤维素水解物水溶液，所述半纤维素水解物水溶液不进行预先灭菌也不进行pH校正,所述水溶液的pH范围为0.5-3,反应体积量通过取出一部分所述反应体积而保持恒定，所述阶段b)以范围为0.001-0.02 h—1的稀释速率进行操作。专利技术优点 本专利技术的一个优点在于，其可以用来在增加的操作期间内提高生产的蛋白的生产率和浓度。特别地，本专利技术的方法可以用来获得多于100 g/L的蛋白浓度。这些表现在实验上以连续模式保持多于400 h。获得的高生产率意味着生物反应器投资成本可以降低。延长期间意味着专门用于清洁生物反应器和接种顺序的时间可以减少。高浓度的纤维素酶意味着后处理的成本可以降低。本专利技术的连续方法的另一个优点在于，其必然具有低kp，这既因为在连续生产阶段b)中应用低稀释速率，还因为在所述阶段b)中使用特定碳质诱导物底物溶液，这意味着反应介质可保持低粘度。专利技术详述 本专利技术的方法优选在范围为3-6的pH，范围为20°C -35 °C的温度，在范围为0.3-1.5min'优选范围为0.3-1 HiirT1的vvm(即，表示为正常温度和压力条件下的空气体积本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于在搅拌和通气的生物反应器中使用丝状真菌菌株生产纤维素酶和半纤维素酶的方法，其包括至少两个阶段：· 用于在封闭反应器中在至少一种碳质生长底物存在的情况下使所述菌株生长的阶段a)，所述生长阶段以10‑90 g/L范围的碳质生长底物浓度实施；· 用于连续生产纤维素酶的阶段b)，其中在至少多于200h的期间内以恒定的供给速率供给至少一种碳质诱导物底物，所述碳质诱导物底物是从木质纤维素底物的酸预处理获得的至少一种半纤维素水解物水溶液，所述半纤维素水解物水溶液不进行预先灭菌也不进行pH校正，所述水溶液的pH范围为0.5‑3，反应体积量通过取出一部分所述反应体积而保持恒定，所述阶段b)以0.002‑0.008 h‑1范围的稀释速率进行操作。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.14 FR 11031491.用于在搅拌和通气的生物反应器中使用丝状真菌菌株生产纤维素酶和半纤维素酶的方法，其包括至少两个阶段: ?用于在封闭反应器中在至少一种碳质生长底物存在的情况下使所述菌株生长的阶段a)，所述生长阶段以10-90 g/L范围的碳质生长底物浓度实施； ?用于连续生产纤维素酶的阶段b)，其中在至少多于200h的期间内以恒定的供给速率供给至少一种碳质诱导物底物，所述碳质诱导物底物是从木质纤维素底物的酸预处理获得的至少一种半纤维素水解物水溶液，所述半纤维素水解物水溶液不进行预先灭菌也不进行pH校正,所述水溶液的pH范围为0.5-3,反应体积量通过取出一部分所述反应体积而保持恒定，所述阶段b)以0.002-0.008 h—1范围的稀释速率进行操作。2.根据权利要求1的方法，其中所述菌株是通过突变、选择或遗传重组而修饰的里氏木霉菌株。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述生长阶段中使用的碳质生长底物选自葡萄糖、乳糖、木糖、木质纤维素底物的酶水解物的单体糖的乙醇发酵后获得的残留物和源自预处理的木质纤维素底物的单体形式的半纤维素级分的提取物，所述碳质生长底物单独使用或作为混合物使用。4.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：F邦沙巴纳，B肖斯皮耶，
申请(专利权)人：IFP新能源公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。