表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途技术

本文报道，对于瞬时转染，人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供增强的生产力(在LC-HC-SM组织中)，与使用SV40polyA信号序列相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供增强的生产力，在包含hCMV启动子的载体中，向bGH PolyA信号序列加入HGT产生提高的生产力，载体组织LC(3`-5′)-HC-SM产生改善的表达。对于稳定库，据报道，用包含hEF1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力，用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数，且用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示更高的IgG表达稳定性。对于单克隆，据报道，选择标记放置在下游的载体组织(LC-HC-SM)对单克隆的生产力具有积极作用，且用包含bGH polyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途本文报道诸如启动子、polyA信号序列和转录终止子的表达载体元件的新组合，表达载体组织，其组合，以及用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
技术介绍
基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响：启动子、polyA信号序列和(如果存在)转录终止子。编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约57bp/19aa)、可变区VH(约350bp/115aa)和恒定区CH(约990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区VK或VL(约350bp/115aa)和恒定区CK或CL(约321bp/107aa)组成。在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见McCafferty，J.等，(编辑)，AntibodyEngineering，APracticalApproach.，IRLPress(1997))。为了发展抗体表达系统，产生包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：‑按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；‑按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；从而获得大量重组哺乳动物细胞；b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.22 EP 11195361.81.用于选择稳定转染的重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链(LC)的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链(HC)的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；其中第一表达盒和第二表达盒单向排列，从而获得大量重组哺乳动物细胞；b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择单个稳定转染的重组哺乳动物细胞，其特征在于所述表达载体进一步包含选择标记(SM)；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。2.权利要求1的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。4.权利要求1的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。5.权利要求1的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。6.权利要求1的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。7.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含以下的哺乳动物细胞：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和b)从所述细胞或培养基回收所述抗体，其中第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞，其特征在于所述表达载体进一步包含SM；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。8.权利要求7的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。9.权利要求7或8的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。10.权利要求7的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。11.权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。12.权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。13.表达载体，其包含：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，其特征在于所述表达载体进一步包含SM；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。14.权利要求13的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。15....

【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·许尔斯曼，H·克内根，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH