表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途技术

本文报道，对于瞬时转染，人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供增强的生产力(在LC-HC-SM组织中)，与使用SV40polyA信号序列相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供增强的生产力，在包含hCMV启动子的载体中，向bGH PolyA信号序列加入HGT产生提高的生产力，载体组织LC(3`-5′)-HC-SM产生改善的表达。对于稳定库，据报道，用包含hEF1α启动子的载体产生的库在分批分析中显示增强的生产力，用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的低产克隆数，且用包含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示更高的IgG表达稳定性。对于单克隆，据报道，选择标记放置在下游的载体组织(LC-HC-SM)对单克隆的生产力具有积极作用，且用包含bGH polyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途本文报道诸如启动子、polyA信号序列和转录终止子的表达载体元件的新组合，表达载体组织，其组合，以及用于产生生产细胞系的新方法，如新的转染或选择方法，以及这些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多肽中的用途。
技术介绍
基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产力。它主要受三种载体元件影响：启动子、polyA信号序列和(如果存在)转录终止子。编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约57bp/19aa)、可变区VH(约350bp/115aa)和恒定区CH(约990bp/330aa)。编码抗体轻链的核酸通常由在蛋白质成熟时去除的前导序列(约66bp/22aa)、可变区VK或VL(约350bp/115aa)和恒定区CK或CL(约321bp/107aa)组成。在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见McCafferty，J.等，(编辑)，AntibodyEngineering，APracticalApproach.，IRLPress(1997))。为了发展抗体表达系统，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化(polyA)区。同样，产生包含重链编码核酸的重链表达盒，该重链编码核酸侧翼是启动子和polyA区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达盒，或者可以整合入两个分开的载体。US7,053,202中报道了免疫球蛋白DNA盒分子、单体(monobody)构建体、产生方法及其使用方法。在US5,168,062中，报道了含有人巨细胞病毒立即早期启动子调节DNA序列的转移载体和微生物。US5,225,348中报道了含有人多肽链延伸因子-1α的启动子区的DNA片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的DNA片段的表达质粒。在US5,266,491中，报道了含有SV40复制起点及具有人多肽链延伸因子-1α基因的启动子区的DNA片段的表达质粒。US5,122,458中报道了重组DNA化合物和诸如tPA的多肽的表达。在US7,422,874中，报道了用于动物细胞的表达载体。SannaPietro，P.报道了抗体Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达(Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395)。Higuchi，K.等(J.Immunol.Meth.202(1997)193-204)报道了用于抗乙型肝炎表面抗原的人抗体的可变区的基因克隆的细胞展示文库。Kim，D.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达系统(Biotechnol.Progress19(2003)1620-1622)。Costa，R.A.等(Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138)报道了用于单克隆抗体产生的细胞工程的指导。Kim，D.W.等报道了用人延伸因子1α启动子作为通用和有效的表达系统(Gene91(1990)217-223)。Buchman，A.R.等(Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405)报道了依赖内含子和不依赖内含子的基因表达的比较。Wang，F.等报道了哺乳动物细胞中的抗体表达(在Therapeuticmonoclonalantibodies-Frombenchtoclinic，Wiley(2009)557-572页中)。Li等(J.Immunol.Meth.318(2007)113-124)报道了用于重组IgG抗体的哺乳动物表达的不同载体设计的比较性研究。Ho，S.C.L.等报道了用于增强高单克隆抗体表达CHO细胞系的产生的IRES介导的三顺反子载体(J.Biotechnol.157(2011)130-139)。Hotta，A.等(J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303)报道了通过重组动物细胞产生抗-CD2嵌合抗体。Lee，J-C.等报道了肠道病毒71内部内糖体进入位点介导的高效蛋白质表达(Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662)。在WO2008/142124中，报道了Avian细胞中的重组蛋白质产生。专利技术概述已发现，表达载体的性能主要取决于其预期用途，用于瞬时转染、稳定库和单克隆选择的最佳载体不同。为了突出主要发现：对于瞬时转染，抗体轻链和重链的双向表达及包括内含子A的全长hCMV启动子的使用是有利的。但是，对于稳定转染，已显示1)抗体轻链、2)抗体重链和3)选择标记的成行排列是有利的。虽然hEF1α启动子在稳定库中明显优于hCMV启动子，但发现了对单克隆水平的明显相反的作用。在此，用人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(hCMV)克隆获得了最高的生产力。此外，hCMV启动子性能可以进一步通过将它与bGHpolyA信号和人胃泌素基因(hGT)的终止子序列组合来改善，其提高生产力和表达稳定性二者。已发现，如果i)启动子是人巨细胞病毒启动子(hCMV)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGHpolyA)，且终止子序列是人胃泌素基因转录终止子序列(hGT)，或2)启动子是人延伸因子1α启动子(hEF1α)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGHpolyA)，且终止子序列缺乏，则包含各含有启动子、结构基因和polyA信号序列及可选的终止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的产生/分泌抗体的细胞克隆。通过使用上述表达载体，可以在转染后获得更高数目的产生/分泌抗体的细胞，从而减少了鉴定适合用于大规模重组抗体产生的高产细胞所需的努力。因此，本文报道的一个方面是用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒，-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，和从而获得大量重组哺乳动物细胞，b)从该大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸是cDNA。在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞。在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细胞。在一个实施方案中，该表达质粒进一步包含选择标记。在一个实施方案中，该表达盒和该选择标记单向排列。在一个实施方案中，该表达盒按LC-HC-SM顺序排列。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是用于选择瞬时转染的细胞的HEK细胞。本文报道的一个方面是用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含以下的哺乳动物细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于选择重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：‑按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；‑按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGH polyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；从而获得大量重组哺乳动物细胞；b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择(单个)重组哺乳动物细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.22 EP 11195361.81.用于选择稳定转染的重组哺乳动物细胞的方法，其包括以下步骤：a)用包含以下的表达载体转染哺乳动物细胞：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链(LC)的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链(HC)的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；其中第一表达盒和第二表达盒单向排列，从而获得大量重组哺乳动物细胞；b)从所述大量重组哺乳动物细胞选择单个稳定转染的重组哺乳动物细胞，其特征在于所述表达载体进一步包含选择标记(SM)；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。2.权利要求1的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。4.权利要求1的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。5.权利要求1的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。6.权利要求1的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于选择稳定转染的细胞的CHO细胞。7.用于产生抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含以下的哺乳动物细胞：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒；和b)从所述细胞或培养基回收所述抗体，其中第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细胞，其特征在于所述表达载体进一步包含SM；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。8.权利要求7的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。9.权利要求7或8的方法，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸是cDNA。10.权利要求7的方法，其特征在于所述表达盒和所述选择标记单向排列。11.权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK细胞、BHK细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。12.权利要求7的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞是用于稳定产生抗体的CHO细胞。13.表达载体，其包含：-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体轻链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第一表达盒；-按5’至3’方向包含hCMV启动子、编码抗体重链的核酸、bGHpolyA信号序列和hGT终止子序列的第二表达盒，其特征在于所述表达载体进一步包含SM；所述表达盒按LC-HC-SM顺序排列。14.权利要求13的表达载体，其特征在于所述编码抗体轻链的核酸和/或所述编码抗体重链的核酸包含至少一个内含子。15....

【专利技术属性】
技术研发人员：P·M·许尔斯曼，H·克内根，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH