本项发明专利技术表观遗传修饰，具体讲是一株黑曲霉NY-1及提高其杀虫活性的改进技术和应用。黑曲霉NY-1(Aspergillus niger)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2014年4月28日，保藏号：CCTCC NO:M 2014169。所述化学表观遗传修饰技术用于提高NY-1发酵产物的杀虫活性并应用于微生物农药。本项发明专利技术涉及菌株分离自山东安丘采集的牛蒡，通过PCR扩增ITS区段，测序结果与Genebank数据库中菌株Aspergillus niger(Accession number:KF358715.1)的相似度为100％。本发明专利技术采用化学表观修饰剂激活一株黑曲霉NY-1的杀虫沉默基因，提高NY-1的杀虫活性，并用于微生物农药。较基因调控和其它沉默基因激活技术，该方法具有快速、低成本、效果明显等优点。
【技术实现步骤摘要】
一株黑曲霉NY-1及提高其杀虫活性的改进技术和应用
本专利技术涉及化学表观遗传修饰技术，更具体地，是一株黑曲霉菌NY-1菌株及提高其杀虫活性的改进技术和应用。菌株NY-1在被化学表观遗传修饰剂作用后，其发酵液的提取物具有更高的杀虫活性。
技术介绍
共生真菌表现出丰富的次生代谢能力，部分次生代谢产物也表现出杀虫活性，但是应用药用植物内生菌发酵法生产天然杀虫药物时，一方面内生菌脱离植物体后，往往次生代谢停止或延缓；另一方面内生菌在自生和共生条件下代谢途径会有所差异。Bok J.W等人在研究巢曲霉(Aspergillus nidulans)的基因组时发现,该菌基因组内有可产生I个職类、2个吲哚生物碱、14个非核糖体多肽以及27个聚酮类化合物的基因存在，但是当在实验条件下发酵培养时，却只能表达出几个次级代谢产物，严重阻碍了真菌天然药物的研究与发展(Chem Biol, 2006，13(1):31-37.)。曲霉属(Aspergillus)是一类在陆地、海洋等各种环境中都广泛分布的真菌,其体内丰富多样的代谢途径使得该属的很多菌株被用于生产活性酶。除此之外已有的文献报道表明该属的有些菌株还具有特异的杀虫活性。黄曲霉(Aspergillus flavus)代谢产生的黄曲霉毒素就是一 种昆虫化学绝育剂；曲酸不仅能影响昆虫的变态，而且可以提高烟碱的杀虫效果；杂色曲霉(Aspergillus versicolor)形成的杂烯亚胺对果蝇成虫有击倒作用。化学表观遗传修饰剂的在天然药物领域的应用为这一问题的解决提供了一种具有前景的方法。表观遗传学(Epigenetics)是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达和功能发生了可遗传的改变，而最终导致了生物表型的变化，这种改变在发育和细胞增殖过程中能够稳定地遗传下去。相对于分子生物学基因调控和其它沉默基因激活技术，该方法具有快速、简便、效果明显、成本低等优点。化学表观遗传修饰是最近几年正在逐渐发展的真菌次生代谢产物研究新技术，其主要是应用化学小分子(组蛋白脱乙酰酶抑制剂和DNA甲基化酶抑制剂)修饰真菌异染色质，激活沉默次生代谢途径基因簇转录，以获得新型的功能分子(Nat.Prod.R印.2010，27(1)，11-22.)。Williams R.B 等利用5-AZA诱导Cladosporium cladosporioides得到三种氧化脂类化合物(Org BiomolChem, 2008，6 (II):1895-1897.)。Jon C 等利用 SAHA 处理黑曲霉(Aspergillus niger)得到一种从未在任何生物体内合成的化合物Nygerone A (Org.Biomol.Chem., 2009, 7:435 -438.)。Robert H.C的课题组主要对真菌的小分子表观遗传修饰剂的作用进行研究。该课题组利用9种DNMT和HDAC小分子抑制剂对12种真菌(包括:Aspergillus flavus、Aspergillus westerdijkiae、 Cladosporium cladosporioides、 Clonostachys sp.、Diatrype sp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum、Rhizopus sp.、Verticillium psalliotae以及另外三种不明丝状真菌)进行诱导，结果表明，其中11种均对表观遗传修饰做出了反应，有的部分次级代谢产物产量提高，有的激活了新的化合物合成等(Nat.Prod.Rep.2010，27，11-22.)。本专利技术采用化学表观遗传修饰技术激活一株黑曲霉NY-1的杀虫功能性沉默次生代谢途径，提高黑曲霉NY-1的杀虫活性。使用化学表观遗传修饰剂激活菌株的次级代谢产物，从而提高菌株的杀虫活性的方法具有靶点明确、效果明显的特点，可应用于微生物资源的开发利用中。
技术实现思路
本项专利技术目的在于提供一株黑曲霉NY-1菌株及提高其杀虫活性的改进技术和应用。为充分达到以上目的，本专利技术采用的技术方案为:一株黑曲霉NY-1菌株，黑曲霉NY-KAspergillus niger)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2014年4月28日，保藏号:CCTCC Ν0:Μ 2014169。将所述黑曲霉于发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-30天，发酵产物待用。所述发酵培养基比例为马铃薯200重量份，葡萄糖20重量份，酵母浸膏3重量份，蛋白胨5重量份，蒸馏水1000重量份，5-氮胞苷8.133X10_6重量份。所述黑曲霉NY-1发酵培养基中的5-氮胞苷用于激活黑曲霉NY-1的沉默代谢途径，提高黑曲霉NY-1发酵液的杀虫活性。将所述黑曲霉NY-1于加入5-氮胞苷的发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-30天，发酵产物待用。将激活后的发酵产物用有机溶剂提取，杀虫活性实验表明提取物具有较正常生长条件下更高的杀虫活性，为正常生长条件下的4.45倍。所述有机溶剂为:石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或水中的一种或几种。所述发酵培养基中加入的5-氮胞苷的浓度为8.133X10_6重量份。经化学表观遗传修饰剂5-氮胞苷作用后，黑曲霉NY-1发酵液的杀虫活性半致死浓度LC5tl为0.037mg/mL,是正常生长条件下杀虫活性的4.45倍。 本专利技术所具有的优点:本专利技术所述的黑曲霉NY-1菌株分离自山东安丘采集的牛蒡，通过PCR扩增18S-28SrDNA的ITS区段，测序结果与Genebank数据库中已知菌株相应序列进行比对，与菌株 Aspergillus niger (Accession number:KF358715.1)的相似度为 100%。此种改进菌株NY-1发酵产物杀虫活性的方法，相对于分子生物学基因调控和其它沉默基因激活技术，其具有简便、快速、低成本、效果明显等优点。【具体实施方式】为阐明对本项专利技术特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本专利技术做进一步阐述。本项专利技术所述的黑曲霉NY-1 (Aspergillus niger),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2014年4月28日，保藏号:CCTCC N0:M2014169，保藏单位地址:武汉市武昌珞珈山。实施例1:滨海植物来源黑曲霉(Aspergillus niger)NY-1菌株分类。I)菌种培养按照微生物学实验室常规培养方法，挑取少量保存于葡萄糖-琼脂培养基的黑曲霉(Aspergillus niger) NY-1,接种于PDA平板表面,25°C培养4天,初期菌落呈蔓延生长，整体为黑色，有白菌丝体，后期孢子黑色，为地毯状，放射型。菌种初步鉴定按照文献方法(东北农业大学学报，2007，38，(I): 101-106)，通过PCR扩增18S-28SrDNA的ITS区段，测序结果与Genebank数据库中已知菌株相应序列进行比对，与菌株 Aspergillus niger (Accession number:KF358715.1)的相似度为 100%。序列信息如下:ACTGGGATCTACTGATCGAGGTCACCTGGAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株黑曲霉菌株，其特征在于：其为黑曲霉NY‑1(Aspergillus niger)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M 2014169。
【技术特征摘要】
1.一株黑曲霉菌株，其特征在于:其为黑曲霉NY-1 (Aspergillus niger)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号:CCTCC NO:M 2014169。2.如权利要求1所述的黑曲霉菌株的发酵产物，其特征在于:将所述黑曲霉在发酵培养基中静置或摇床发酵培养15-30天。3.如权利要求2所述的黑曲霉菌株的发酵产物，其特征在于培养基包括:马铃薯200重量份，葡萄糖20重量份，酵母浸膏3重量份，蛋白胨5重量份，5-氮杂胞苷(5-AZA) 8.133X 10_6重量份和蒸馏水1000重量份。4.一种提高菌株黑曲霉NY-1抗虫活性的方法，其特征在于:在发酵培养基中加入12.2X 10_6重量份的5-氮杂胞苷(5-AZA)。5.一种权利要求1所述的黑曲霉作为微生物农药杀虫剂的应用。6.如权利要求5所述的黑曲霉作为微生物农药杀虫剂中的应用，其特征在于:所述黑曲霉置于发酵培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昉，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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