本发明专利技术公开了一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法，将30克陶粒放入组培瓶中，加植物营养液40mL至刚好没过陶粒，将生防菌浸种处理过的催芽的辣椒种子定植在陶粒上，待辣椒长至四片真叶，在营养液面以下接种5mL调整浓度为105mL-1的游动孢子悬浮液。游动孢子悬浮液由辣椒疫霉菌在CA培养基上间歇光照处理6~8天后低温诱导得到。应用范围为以辣椒疫病为靶标的生防菌的筛选等。本发明专利技术的方法操作简单，从育苗到接种周期短，游动孢子接种便于实施和观察，在植物病害的生物防治研究工作中具有实际的指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业植物保护
，涉及多种农作物疫病流行病的筛选方法，更具体的说是。
技术介绍
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌从ora capsici Leonian)引起的一种世界性土传病害，在各辣椒产区均有发生。其病原菌除危害辣椒外，也可侵染西葫芦、黄瓜、南瓜、茄子、番茄等20多种作物。该病害1918年首次在美国新墨西哥州报道，现已在全世界普遍发生。我国最初由愈大绂于20世纪60年代在江苏发现此病，至今辣椒疫病已在新疆、河北、黑龙江、贵州、广州、甘肃、云南、上海和陕西等省(市)发生危害。除我国外，在法国、澳大利亚、韩国以及印度等国均有发生。近年来随着保护地辣椒种植面积的增加以及辣椒在各主产区的连茬种植，辣椒疫病的发生有逐年加重的趋势。由于辣椒疫病流行，露地和保护地均发生，常导致植株成片死 亡损失严重，一般田块株发病率20%~30%，发病田块达70%以上，严重地影响了辣椒的产量，给农民造成了巨大的损失。辣椒疫霉菌(/%_7(0/7况力ora capsici Leonian)主要以卵孢子、厚垣孢子在植株病残体、土壤或种子中越冬，可存活2~3年，成为来年病害的初侵染源。越冬后的病菌经雨水或浇水时反溅而传到辣椒茎基部或叶片、果实上引起发病，尤其是大雨后天气突然转晴，气温急剧上升病害极易发生流行。病菌生长发育适温30°C，最高38°C，最低8°C。一般田间温度25~28°C，相对湿度高于85%的情况下最利于该菌的侵染。病菌从侵入到发病，潜育期不过3~4天，病叶上产生的孢子囊随灌水、气流等传到寄主各部位，又可传播为害，不断引起再侵染，造成病害的流行。目前尚无有效防治辣椒疫病的抗病品种，生产上防治主要是以化学药剂为主。但是由于长期使用化学药剂，P.capsici已对大多数常用农药产生了不同程度的抗药性，由于土壤吸附和微生物降解作用，使用化学药剂防治疫病效果不佳，而且化学农药的大量、高频使用带来严重的环境和农产品中农药残留问题。据报道，我国已有多个地区利用自然界有益微生物对植物病害进行生物防治，防治效果较好。长期以来，辣椒疫病的生物防治工作进展缓慢，其中辣椒疫病生防菌的筛选困难是制约辣椒疫病研究的瓶颈之一。为了顺利进行辣椒疫病生物防治的研究，关键是寻求一种针对辣椒疫病生防菌高效的筛选方法。因此，研究一种高效、简便、可行的以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法成为辣椒疫病生物防治以及种农作物疫病流行病筛选工作的重要保障。
技术实现思路
通常的生防菌株筛选采用的是室内盆栽试验或者田间小区试验两种方法，这两种方法从试验准备、试验设计及试验实施三方面来讲要求较高，而且周期长。本专利技术以辣椒疫病为靶标的生防菌株筛选方法，采用无土栽培方法，陶粒(又称陶化营养土)作为基质，组培瓶作容器试验用品价格低廉、便于买到且可重复使用，节约了试验成本；种植要求简单，游动孢子接种便于实施和观察，周期短，筛选高效。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的技术方案: ，其特征在于，包括如下步骤: (I)种子消毒:将所需数目的辣椒种子用无菌水冲洗一遍，然后先后用75%的酒精和5%的NaClO分别处理30s和5min，选育辣椒品种为改良8819线椒，由青县钰禾蔬菜育种中心提供(对外有售)。(2)种子催芽:将消毒处理的种子于无菌水中浸泡4h，后放入铺有湿纱布的培养皿中，25°C的培养箱中避光48h催芽至露白； (3)基质灭菌:将30克陶粒放入组培瓶中，高度为组培瓶高度的1/3，加植物营养液40mL至刚好没过陶粒，用封瓶膜封好。湿热灭菌，121°C，30min;其中，陶粒直径疒8 mm，购买于曹庄子花卉市场。组培瓶高100 mm，口径50 mm，外径60 mm，购买于天津市津百顺实验设备有限公司； 所述的植物营养液的配制:1升去离子水中加磷酸铵0.22克、硝酸钾1.05克、硫酸铵和硝酸铵各0.16克、硫酸亚铁0.01克，混匀即为营养液； (4)生防菌浸种:用挑针挑取拮抗细菌菌株的单菌落，转移至装有50mL LB细菌培养液的三角瓶中，于37°C、150r.mirT1震荡培养18 h制成拮抗菌液(调整拮抗菌液菌含量为1.0X IO8 cfu 将已催芽的种子浸入拮抗菌液浸种30 min ;所述的拮抗细菌菌株指的是从蔬菜根际土壤中分离出来后通过平板拮抗实验筛选的对辣椒疫霉拮抗效果较好的菌株，来源:由天津市植物保护研究所农业微生物发酵研究室提供(对外可以免费提供)。LB细菌培养液指的是=LB细 菌培养液的制备:1升去离子水中加蛋白胨10克，酵母浸膏5克，NaCl 5 克。(5)定植:将已处理的种子用镊子均匀点入灭菌基质中，每瓶点8粒种子，封上封瓶膜，放入人工气候箱培养，人工气候箱参数设置为:温度为26°C，湿度为50%，光照16h，黑暗8h ;灭菌基质指的是步骤(3)中的陶粒； (6)营养液的添加:每周检查营养液的消耗情况，营养液的添加(指的是上面提到的植物营养液)以不没过种子为宜； (7)游动孢子制备:将辣椒疫霉菌接种在CA培养基(胡萝卜培养基)上，间歇光照处理61天后，镜检孢子囊数量，当镜检视野中有大量孢子囊时，向培养皿中加10 mL无菌自来水，于4°C放置lh，随后室温光照Ih诱导游动孢子释放，然后用消毒毛笔刷洗培养基表面，四层灭菌纱布过滤，收集游动孢子悬浮液，镜检游动孢子数量，调整接种浓度为IO5 mL-1 ； 所述的辣椒疫霉菌指的是:由天津市植物保护研究所植病生防室提供(对外可以免费提供)。所述的CA培养基指的是胡萝卜培养基。制备方法为:将200克胡萝卜切片，加500mL去离子水，匀浆机将打碎，双层纱布过滤，加去离子水补至I升，加20克琼脂，每瓶100 mL分装，灭菌备用。(8)病原菌接种:定植28天后待辣椒长出四片真叶，将移液枪头插入营养液面以下接种5 mL调整浓度为IO5 mL—1的游动孢子悬浮液，为了利于辣椒疫病的发生，接种后人工气候箱参数设置为:温度为28°C，湿度为70%，光照8h，黑暗16h。接种后第3、5天调查发病情况。本专利技术更加详细的描述如下:，包括如下步骤: (I)种子消毒:将所需数目的辣椒种子，例如选育由青县钰禾蔬菜育种中心提供的辣椒品种为改良8819线椒作为辣椒种子。用无菌水冲洗一遍，然后先后用75%的酒精和5%的NaClO分别处理30s和5min。(2)种子催芽:将消毒处理的种子于无菌水中浸泡4h，后放入铺有湿纱布的培养皿中，25°C的培养箱中避光48h催芽至露白。(3)基质灭菌:将30克陶粒放入组培瓶中，高度大约为组培瓶高度的1/3，加植物营养液40mL至刚好没过陶粒，用封瓶膜封好。湿热灭菌，121 °C，30min。其中，陶粒直径2~8mm，购买于曹庄子花卉市场。组培瓶高100 mm，口径50 mm，外径60 mm，购买于天津市津百顺实验设备有限公司。植物营养液的配制:I升去离子水中加磷酸铵0.22克、硝酸钾1.05克、硫酸铵和硝酸铵各0.16克、硫酸亚铁0.01克，混匀即为营养液。(4)生防菌浸种:用挑针挑取拮抗细菌菌株的单菌落，转移至装有50 mLLB细菌培养液的三角瓶中，于37°C、150r.mirT1震荡培养18 h制成拮抗菌液(调整菌含量为1.0XlO8 cfu.ml/1),将已催芽的种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行：(1) 种子消毒：将所需数目的辣椒种子用无菌水冲洗一遍，然后先后用75%的酒精和5%的NaClO分别处理30s和5min，选育辣椒品种为改良8819线椒；(2) 种子催芽：将消毒处理的种子于无菌水中浸泡4h，后放入铺有湿纱布的培养皿中，25℃的培养箱中避光48h催芽至露白；(3) 基质灭菌：将30克直径2~8 ㎜陶粒放入组培瓶中，陶粒高度为组培瓶高度的1/3，加植物营养液40mL，用封瓶膜封好；湿热灭菌，121℃，30min； (4) 生防菌浸种：用挑针挑取拮抗细菌菌株的单菌落，转移至装有50 mL LB细菌培养液的三角瓶中，于37℃、150r·min‑1震荡培养18 h制成含量为1.0×108 cfu·mL‑1拮抗菌液，将已催芽的种子浸入拮抗菌液浸种30 min；所述的LB细菌培养液指的是： 1升去离子水中加蛋白胨10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克；(5) 定植：将已处理的种子用镊子均匀点入步骤（3）灭菌基质中，每瓶点8粒种子，封上封瓶膜，放入人工气候箱培养，人工气候箱参数设置为：温度为26℃，湿度为50%，光照16h，黑暗8h； (6) 植物营养液的添加：每周检查植物营养液的消耗情况，植物营养液的添加以不没过种子为宜；(7) 游动孢子制备：将辣椒疫霉菌接种在CA培养基上，间歇光照处理6~8天后，镜检孢子囊数量，当镜检视野中有大量孢子囊时，向培养皿中加10 mL无菌自来水，于4℃放置1h，随后室温光照1h诱导游动孢子释放，然后用消毒毛笔刷洗培养基表面，四层灭菌纱布过滤，收集游动孢子悬浮液，镜检游动孢子数量，调整接种浓度为105 mL‑1；所述的CA培养基指的是胡萝卜培养基，其配方为：将200克胡萝卜切片，加500 mL去离子水，匀浆机将胡萝卜片打碎，双层纱布过滤，加去离子水补至1升，加20克琼脂，每瓶100 mL分装，灭菌备用； (8) 病原菌接种：定植28天后待辣椒长出四片真叶，将移液枪头插入营养液面以下接种5 mL调整浓度为105 mL‑1的游动孢子悬浮液，接种后人工气候箱参数设置为：温度为28℃，湿度为70%，光照8h，黑暗16h，接种后第3、5天调查发病情况。...
【技术特征摘要】
1.一种以辣椒疫病为靶标的生防菌株高效筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)种子消毒:将所需数目的辣椒种子用无菌水冲洗一遍，然后先后用75%的酒精和5%的NaClO分别处理30s和5min，选育辣椒品种为改良8819线椒； (2)种子催芽:将消毒处理的种子于无菌水中浸泡4h，后放入铺有湿纱布的培养皿中，25°C的培养箱中避光48h催芽至露白； (3)基质灭菌:将30克直径2~8mm陶粒放入组培瓶中，陶粒高度为组培瓶高度的1/3，加植物营养液40mL，用封瓶膜封好；湿热灭菌，12rC,30min ； (4)生防菌浸种:用挑针挑取拮抗细菌菌株的单菌落，转移至装有50mL LB细菌培养液的三角瓶中，于37°C、150r.min—1震荡培养18 h制成含量为1.0XlO8 cfu.mL-1拮抗菌液，将已催芽的种子浸入拮抗菌液浸种30 min ;所述的LB细菌培养液指的是:I升去离子水中加蛋白胨10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克； (5)定植:将已处理的种子用镊子均匀点入步骤(3)灭菌基质中，每瓶点8粒种子，封上封瓶膜，放入人工气候箱培养，人工气候箱参数设置为:温度为26°C，湿度为50%，光照16h，黑暗 8h ； (6)植物营养液的添 加:每周检查植物营养液的消耗情况，植物营养液的添加以不没过种子为宜； (7)游动孢子制备:将辣椒疫霉菌接种在CA培养基上，间歇光照处理61天后，镜检孢子囊数量，当镜检视野中...
【专利技术属性】
技术研发人员：田涛，孙冰冰，李伟，魏军，
申请(专利权)人：天津市植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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