一种山楂中黄酮成分的荧光检测方法技术

本发明专利技术提供了一种山楂中黄酮成分的荧光检测方法：先用甲醇提取山楂得到山楂提取液，稀释后作为样品液，进行毛细管电泳荧光检测，毛细管柱中填充微乳缓冲溶液，所述微乳缓冲溶液的成分为：两性离子表面活性剂3～12mg/mL、助表面活性剂55～70mg/mL、乙酸乙酯4.5～6mg/mL、2.5～10mmol/L的缓冲盐、pH值为8～10。然后根据对照品的标准曲线计算得到山楂中各黄酮成分的含量。本发明专利技术针对现有色谱技术的不足，提供了一种制备简单、溶解能力好、粘度低、稳定性好的微乳缓冲液，并在缓冲液中创新使用中性两性离子表面活性剂；同时，本发明专利技术优先使用灵敏度高、重复性好的发光二极管诱导荧光检测器，并在黄酮检测方面取得了显著的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用发光二极管诱导荧光器的中药检测方法，可实现对山楂中不同黄酮成分的品质检测，属于中药分析检测
。
技术介绍
山楂，蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatif ida Bge.的干燥成熟果实。山楂果中含糖类、蛋白质、黄酮类化合物、胡萝卜素、淀粉、苹果酸、钙、铁等物质，但以黄酮类化合物含量最高。山楂入药已久，据药典记载，山楂具有消积化滞、活血化淤、扩张血管、增加冠脉血流量、改善心脏活力、兴奋中枢神经系统、软化血管及利尿和镇静等作用。最新研究还发现山楂果中的牡荆素化合物对癌细胞体内生长、增殖和浸润转移有一定的抑制作用。当今社会，高血压、高血脂等心脑血管疾病已严重影响人类的身体健康，因此，对具有降压、降脂功效的药物的开发变得越来越重要；研究表明，黄酮类化合物在这方面具有较好的疗效，而黄酮类物质广泛存在于自然界的某些植物和浆果中，且具有多种结构；许多年前，科学家在银杏树中提取出了黄酮，现主要在银杏叶和山楂叶中提取，但是含量相对较低，提取工艺还存在限制。而山楂果实中含有丰富的黄酮，具有很高的利用价值。近年来，以色谱为主的现代分析技术已广泛应用于山楂体系，并且获得了一定的效果。但是，荧光分析特别是对发光二极管诱导荧光检测分析的报道并不多见。荧光是一种自然发光反应，它是利用频率相同的光照射样品，使样品中的电子吸收能量后发生跃迁，从而释放出光。目前对山楂成分的研究表明，具有多个共轭结构或刚性的平面结构的物质能产生荧光。而黄酮类物质作为这样的存在能在检测器下被检测。同时，发光二极管诱导荧光检测法是一种高效、快速、微量的检测方法，而LED作为光源具有结构简单、性能稳定、造价低廉的优点。微乳电动色谱应用广泛，能同时分离水溶性的、脂溶性的、带电的和不带电的物质，微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和盐溶液所形成的稳定透明液体。微乳的种类按表面活性剂可分为阴离子表面活性剂微乳、阳离子表面活性剂微乳、两性离子表面活性剂微乳和非离子表面活性剂微乳。目前，还未见有关使用中性两性离子表面活性剂形成的微乳来作为固定相的报导。基于上述背景，有效检测山楂中各种黄酮成分将有助于山楂分析工作的开展。目前，已有较多文献报导对山楂中黄酮成分的检测，但检测的方法以及仪器的选择和使用较为单一，基本是以高效液相色谱作为主要的检测体系，但HPLC成本高，需要各种填料柱，流动相消耗大且有毒性的居多。鉴于上述问题，本专利技术提供了一种方便，安全且检测准确度稳定的一种突光检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、方便、准确进行山楂黄酮检测的方法。该技术针对现有色谱技术的不足，提供了一种制备简单、溶解能力好、粘度低、稳定性好的微乳缓冲液，并在缓冲液中创新使用两性离子表面活性剂；同时，本专利技术优先使用灵敏度高、重复性好的发光二极管诱导荧光检测器，并在黄酮检测方面取得了显著的效果。本专利技术采用的技术方案是:，所述方法包括以下步骤:(I)山楂粉末加入甲醇溶剂，甲醇的体积用量以山楂粉末的质量计为10?30mL/g(优选15mL/g)，称定重量为M，密闭后加热超声提取30?60分钟，冷却后加入甲醇补足至重量M，混匀后用0.22μπι规格的有机膜过滤，离心，取续滤液制得山楂提取液；(2)取步骤(I)所得山楂提取液，用甲醇稀释10?15体积倍后作为样品液进样，进行毛细管电泳荧光检测，毛细管柱中填充微乳缓冲溶液，所述微乳缓冲溶液的成分为:两性离子表面活性剂3?12mg/mL、助表面活性剂55?70mg/mL、乙酸乙酯4.5?6mg/mL、2.5?IOmmoI/L的缓冲盐、pH值为8?10，25?30°C下超声20?30分钟，过滤、制得微乳缓冲溶液；以发光二极管光诱导荧光检测器进行检测，检测波长480nm，得到样品液的毛细管电泳荧光光谱图；(3)以山奈素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照步骤(2)同样条件进行毛细管电泳色谱检测，获得山奈素对照品的毛细管电泳荧光光谱图，以山奈素对照品的浓度为横坐标，以山奈素对照品溶液的毛细管电泳荧光光谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作山奈素标准曲线，按同样方法制作芹菜素标准曲线、槲皮素标准曲线、异牡荆素标准曲线、牡荆素标准曲线、异槲皮素标准曲线、金丝桃苷标准曲线；根据样品液的毛细管电泳荧光光谱图中相应色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量，相应换算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量。所述两性离子表面活性剂为3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱或3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱，优选为3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱。所述助表面活性剂为异丙醇、正丁醇、戊醇或环己醇，优选为正丁醇。所述缓冲盐为tris或硼砂，优选为硼砂。进一步，优选硼砂在缓冲液中的浓度为5mmol/L。所述微乳缓冲溶液的pH值为8?10，优选为9。进一步，优选所述微乳缓冲溶液的成分为:两性离子表面活性剂6mg/mL、助表面活性剂60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的缓冲盐、pH值为9 ；更优选的，优选所述微乳缓冲溶液的成分为:3_磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱6mg/mL、正丁醇 60mg/mL、乙酸乙酯 5mg/mL、5mmol/L 的硼砂、pH 值为 9。所述步骤(I)中，所述毛细管电泳条件为:分离电压:30KV，柱温:35°C。所述步骤(2)中，所述过滤优选用0.22 μ m规格的有机膜过滤。所述步骤(I)中，所述加热超声提取优选加热至40?50°C，在100W，40kHz的条件下超声提取。所述步骤(2)中，所述超声优选在100W，40kHz的条件下进行。所述毛细管电泳可采用常规毛细管电泳设备，使用未涂层熔融石英毛细管柱，进样可采用压力进样或电压进样。所述步骤(I)中，所述山楂提取液优选按以下步骤制得:山楂粉末(过三号筛)约1.0g,精密称定，置具塞广口瓶中，精密加入甲醇15mL，称定重量，加热40?50°C超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μ m规格的有机膜过滤，离心，取续滤液，即得山楂提取液。较为具体的，推荐本专利技术所述方法按以下步骤进行:(I)过三号筛的山楂粉末1.0g，精密称定，置具塞广口瓶中，精密加入甲醇15mL，称定重量M，加热40?50°C超声40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量至重量M，摇匀，用0.22 μ m规格的有机膜过滤，离心，取续滤液，即得山楂提取液；(2)取步骤(I)所得山楂提取液，用甲醇稀释10?15体积倍后作为样品液进样，进行毛细管电泳荧光检测，毛细管电泳条件为:分离电压:30KV，柱温:35°C，毛细管柱中填充微乳缓冲溶液，所述微乳缓冲溶液的成分为:3_磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱6mg/mL、正丁醇60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mmol/L的硼砂、pH值为9, 25?30°C下超声20?30分钟，过滤、制得微乳缓冲溶液；以发光二极管光诱导荧光检测器进行检测，检测波长480nm，得到样品液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山楂中黄酮成分的荧光检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）山楂粉末加入甲醇溶剂，甲醇的体积用量以山楂粉末的质量计为10～30mL/g，称定重量为M，密闭后加热超声提取30～60分钟，冷却后加入甲醇补足至重量M，混匀后用0.22μm规格的有机膜过滤，离心，取续滤液制得山楂提取液；（2）取步骤（1）所得山楂提取液，用甲醇稀释10～15体积倍后作为样品液进样，进行毛细管电泳荧光检测，毛细管柱中填充微乳缓冲溶液，所述微乳缓冲溶液的成分为：两性离子表面活性剂3～12mg/mL、助表面活性剂55～70mg/mL、乙酸乙酯4.5～6mg/mL、2.5～10mmol/L的缓冲盐、pH值为8～10，25～30℃下超声20～30分钟，过滤、制得微乳缓冲溶液；以发光二极管光诱导荧光检测器进行检测，检测波长480nm，得到样品液的毛细管电泳荧光光谱图；所述两性离子表面活性剂为3‑磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱、3‑磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱或3‑磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱；所述助表面活性剂为异丙醇、正丁醇、戊醇或环己醇；所述缓冲盐为tris或硼砂；（3）以山奈素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照步骤（2）同样条件进行毛细管电泳色谱检测，获得山奈素对照品的毛细管电泳荧光光谱图，以山奈素对照品的摩尔浓度为横坐标，以山奈素对照品溶液的毛细管电泳荧光光谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作山奈素标准曲线，按同样方法制作芹菜素标准曲线、槲皮素标准曲线、异牡荆素标准曲线、牡荆素标准曲线、异槲皮素标准曲线、金丝桃苷标准曲线；根据样品液的毛细管电泳荧光光谱图中相应色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量，相应换算得到山楂中山奈素、芹菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量。...

【技术特征摘要】
1.一种山楂中黄酮成分的荧光检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: (O山楂粉末加入甲醇溶剂，甲醇的体积用量以山楂粉末的质量计为10~30mL/g，称定重量为M,密闭后加热超声提取30~60分钟,冷却后加入甲醇补足至重量M,混匀后用0.22μπι规格的有机膜过滤，离心，取续滤液制得山楂提取液； (2)取步骤(1)所得山楂提取液，用甲醇稀释10~15体积倍后作为样品液进样，进行毛细管电泳荧光检测，毛细管柱中填充微乳缓冲溶液，所述微乳缓冲溶液的成分为:两性离子表面活性剂3~12mg/mL、 助表面活性剂55~70mg/mL、乙酸乙酯4.5~6mg/mL、2.5~IOmmoI/L的缓冲盐、pH值为8~10，25~30°C下超声20~30分钟，过滤、制得微乳缓冲溶液； 以发光二极管光诱导荧光检测器进行检测，检测波长480nm，得到样品液的毛细管电泳突光光谱图； 所述两性离子表面活性剂为3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱、3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱或3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱； 所述助表面活性剂为异丙醇、正丁醇、戊醇或环己醇； 所述缓冲盐为tris或硼砂； (3)以山奈素的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照步骤(2)同样条件进行毛细管电泳色谱检测，获得山奈素对照品的毛细管电泳荧光光谱图，以山奈素对照品的摩尔浓度为横坐标，以山奈素对照品溶液的毛细管电泳荧光光谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作山奈素标准曲线，按同样方法制作芹菜素标准曲线、槲皮素标准曲线、异牡荆素标准曲线、牡荆素标准曲线、异槲皮素标准曲线、金丝桃苷标准曲线；根据样品液的毛细管电泳荧光光谱图中相应色谱峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算样品液中山奈素、芹菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量，相应换算得到山楂中山奈素、芳:菜素、槲皮素、异牡荆素、牡荆素、异槲皮素、金丝桃苷含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述两性离子表面活性剂为3-磺丙基十二烷基~二甲基甜菜喊。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述助表面活性剂为正丁醇。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述缓冲盐为硼砂。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述毛细管电泳条件为:分离电压:30KV，柱温:35°Co6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述微乳缓冲溶液的成分为:两性离子表面活性剂6mg/mL、助表面活性剂60mg/mL、乙酸乙酯5mg/mL、5mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹君，曹婉，胡帅帅，庞潇卿，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33