一种单粒玉米种子活力快速检测方法技术

本发明专利技术涉及一种单粒玉米种子活力快速检测方法，包括以下步骤：利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取玉米胚乳核DNA；利用酶联免疫法（ELISA）检测玉米胚乳核DNA中8-OHdG的含量；通过建立种子老化模型和检测玉米胚乳核DNA中8-OHdG氧化水平实现对玉米胚乳核DNA氧化损伤的检测，快速检测单粒玉米种子活力。本发明专利技术提供的方法，分析速度快，简单且准确的实现单粒玉米种子的活力检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及种子活力检测技术，特别是涉及。
技术介绍
种子活力是种子质量的重要指标。高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，是单粒播种的关键。近年来，我国玉米生产逐渐向机械化单粒精量播种的方向发展。因此，有必要建立快速、简便且准确的单粒玉米种子的活力检测方法。现有测定玉米种子活力的方法主要包括:(I)发芽实验，真实客观，但耗时长，且会消耗种子库存量；(2)2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、红墨水染色法，简单快速，但破坏种子结构，准确性和灵敏度也差；(3) Q2技术，通过测定呼吸参数快速、准确的测定种子活力，不破坏种子的完整性，但需要昂贵的专门仪器。玉米种子由胚和胚乳两大部分组成，其基因型分别为2η和3η，但它们的DNA组成相同。玉米种子成熟后，活力会发生不可逆转的劣变。核DNA在种子劣变过程中最容易遭受氧化损伤，尤其是DNA中的鸟嘌呤，其氧化产物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤最常用的生物标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有种子活力检测方法耗时长、种子用量大、准确性差的缺陷，提供一种快速、准确的单粒玉米种子活力检测的方法。通过检测玉米胚乳中核DNA氧化损伤程度分析单粒种子的活力，以适应玉米精播生产的需要。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现: ，它由以下步骤组成:玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析。所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB);所述玉米胚乳核DNA氧化损伤检测利用酶联免疫法(ELISA)检测胚乳核DNA中8-OHdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通过建立种子老化模型实现。，它由以下步骤组成: a、利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取单粒玉米胚乳核DNA ； Cl)室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13^0.17 g ； (2)将(I)中所得胚乳和0.9^1.1 ml预热的65°C的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；(3)将(2)中所得的匀浆状的胚乳在65°C温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次； (4)保育结束后，将(3)中所得的胚乳室温放置5min ；(5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9^1.1 ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (6)将(5)所得胚乳以5600^6400g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入0.9^1.1 ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (8)将(7)所得物以5600^6400g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次； (10)将(9)所得物在4°C温度下保育I小时； (11)将(10)所得物以5600~6400g离心力离心5 min，离心后收集沉淀; (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9^1.1 ml，轻轻上下颠倒3 min ； (13)将(12)中所得物以5600~6400g离心力离心5 min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)将(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶联免疫法(ELISA)检测胚乳DNA中8-OHdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买； (1)在96 孔板的各孔加浓度分别为 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 40 pg/ml,80 pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各48~52 μL，向各标准液和样品溶液中分别加第一抗体溶液48、2μL,摇晃酶标板使其充分混合,封盖后在37°C的环境中温浴I h ； (2)反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230-270PL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次； (3)向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37°C环境中温浴Ih ； (4)将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104μL，封盖后在常温下反应15 min ;反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合； (5)向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104PL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值； (6)用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度； C、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。，它由以下步骤组成: a、利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取单粒玉米胚乳核DNA ； Cl)室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2 h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14?.16 g ； (2)将(I)中所得胚乳和0.95^1.05 ml预热的65°C的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中； (3)将(2)中所得的匀浆状的胚乳在65°C温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次； (4)保育结束后，将(3)中所得的胚乳室温放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95~1.05 ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (6)将(5)所得胚乳以5800~6200g离心力离心5 min，离心后收集上清液;(7)向(6)中所得上清液中加入0.95~1.05 ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (8)将(7)所得物以5800^6200g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；(10)将(9)所得物在4°C温度下保育I小时； (11)将(10)所得物以5800~6200g离心力离心5 min，离心后收集沉淀; (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05 ml,轻轻上下颠倒3 min ； (13)将(12)中所得物以5800~6200g离心力离心5 min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)将(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 49~5?μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶联免疫法(ELISA)检测胚乳DNA中8-OHdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买； (1)在96 孔板的各孔加浓度分别为 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析。

【技术特征摘要】
1.一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于:它由以下步骤组成:玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析。2.如权利要求1所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于:所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB);所述玉米胚乳核DNA氧化损伤检测利用酶联免疫法(ELISA)检测胚乳核DNA中8_0HdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通过建立种子老化模型实现。3.如权利要求1或2所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于:它由以下步骤组成: a、利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取单粒玉米胚乳核DNA； (1)室温下，老化Od，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13^0.17 g ； (2)将(1)中所得胚乳和0.9^1.1 ml预热的65°C的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中； (3)将(2)中所得的匀浆状的胚乳在65°C温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次； (4)保育结束后，将(3)中所得的胚乳室温放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.9^1.1 ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (6)将(5)所得胚乳以5600^6400g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入0.扩1.1 ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (8)将(7)所得物以5600^6400g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次； (10)将(9)所得物在4°C温度下保育I小时； (11)将(10)所得物以5600~6400g离心力离心5 min，离心后收集沉淀; (12)向(11)中所得沉淀加入70%乙醇0.9^1.1 ml，轻轻上下颠倒3 min ； (13)将(12)中所得物以5600~6400g离心力离心5 min，离心后收集沉淀，室温干燥，得到玉米胚乳核DNA ； (14)将(13)所得玉米胚乳核DNA 溶于 48~52μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中； b、利用酶联免疫法(ELISA)检测胚乳DNA中8_0HdG的含量； 胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买； (1)在96 孔板的各孔加浓度分别为 2.5 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml,40 pg/ml,80 pg/ml的8_0HdG标准液和样品溶液各48~52 μL，向各标准液和样品溶液中分别加第一抗体溶液48、2μL,摇晃酶标板使其充分混合,封盖后在37°C的环境中温浴I h ； (2)反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230-270PL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次； (3)向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37°C环境中温浴1h ； (4)将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104μL，封盖后在常温下反应15 min ;反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；(5)向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104PL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值； (6) 用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度； C、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。4.如权利要求1或2或3所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于:它由以下步骤组成: a、利用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取单粒玉米胚乳核DNA； (1)室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14?.16 g ； (2)将(I)中所得胚乳和0.95^1.05 ml预热的65°C的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中； (3)将(2)中所得的匀浆状的胚乳在65°C温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次； (4)保育结束后，将(3)中所得的胚乳室温放置5min ； (5)向(4)中所得的胚乳中加入0.95~1.05 ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (6)将(5)所得胚乳以5800^6200g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (7)向(6)中所得上清液中加入0.95~1.05 ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀； (8)将(7)所得物以5800^6200g离心力离心5 min，离心后收集上清液； (9)向(8)中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次； (10)将(9)所得物在4°C温度下保育I小时； (11)将(10)所得物以5800~6200g离心力离心5 min，离心后收集沉淀; (12)向(...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，吴晓林，巩方平，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41