一种MDM2拮抗剂的检验试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术针对现有MDM2拮抗剂检验方法繁琐、耗时、不利于快速大量筛选的缺陷，发明专利技术了一种新的MDM2拮抗剂检验试剂盒。所述检验试剂盒包含连接于载体的MDM2，结合于MDM2上的p53和连接于p53的报告蛋白。所述的蛋白质通过同一表达载体上共表达p53基因和MDM2基因的相关部分，其中MDM2基因中融合了可以表达用于结合载体的标签，p53基因中融合了用于表达荧光蛋白的基因序列。通过使用所述新的MDM2拮抗剂检验试剂盒，直观指示MDM2与p53之间的结合变化，同时，将MDM2拮抗剂的筛选工作大大简化，以便快速确定新的候选MDM2拮抗剂。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术针对现有MDM2拮抗剂检验方法繁琐、耗时、不利于快速大量筛选的缺陷，专利技术了一种新的MDM2拮抗剂检验试剂盒。所述检验试剂盒包含连接于载体的MDM2，结合于MDM2上的p53和连接于p53的报告蛋白。所述的蛋白质通过同一表达载体上共表达p53基因和MDM2基因的相关部分，其中MDM2基因中融合了可以表达用于结合载体的标签，p53基因中融合了用于表达荧光蛋白的基因序列。通过使用所述新的MDM2拮抗剂检验试剂盒，直观指示MDM2与p53之间的结合变化，同时，将MDM2拮抗剂的筛选工作大大简化，以便快速确定新的候选MDM2拮抗剂。【专利说明】一种MDM2拮抗剂的检验试剂盒及其制备方法
本专利技术属于分子生物学和生物
，具体涉及一种MDM2拮抗剂检验方法，包括MDM2基因和p53基因共表达质粒的构建、共表达质粒表达的产物和用所述产物检验候选MDM2拮抗剂的方法。
技术介绍
癌症威胁着人类的健康和生命。传统放疗、化疗的严重毒副作用一直是抗癌研究与治疗关注的焦点，近年来，抗癌药物研究已从传统的细胞毒类药物逐渐转向特异性的分子靶向治疗药物，发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒新型药物已成为抗癌药物研发的重要方向。研究表明，p53基因是与人类癌症相关性最高的抑癌基因，其表达产物是细胞生长的重要调节子，结合在一定的DNA序列，能够激活基因转录，抑制细胞生长。MDM2基因是1987年发现的癌基因，其表达产物MDM2蛋白可与p53结合，并抑制p53的正常生物学功能，从而可导致肿瘤的发生和发展。理论上，阻断P53和MDM2之间的相互作用，能够回复野生型P53活性，驱动癌细胞选择性地进入程序性细胞死亡，因此，阻断MDM2和p53相互作用被认为是抗癌药物研究的重要靶点之一。p53的15-29位氨基酸和MDM2的17-125位氨基酸是两者结合的关键。本专利技术之前的现有技术中，MDM2拮抗剂主要是根据p53-MDM2复合物的结构数据设计，然后通过蛋白质表达体系得到蛋白质，利用ELISA方法测定其与MDM2结合的Kd值。这种方法较为繁琐，时间消耗大，不利于快速大量筛选。
技术实现思路
为了克服现有技术中检验MDM2拮抗剂方法繁琐、耗时、不利于快速大量筛选的缺陷，以快速有效的筛选天然的或人工设计的MDM2拮抗剂为目的，本专利技术提供一种MDM2拮抗剂检验试剂盒，采用共表达P53和MDM2相关部分并使用荧光蛋白直观、高效地对候选MDM2拮抗剂进行检验。本专利技术包括以下各项内容:1.一种MDM2拮抗剂检验试剂盒，包含连接于载体的MDM2，结合于MDM2上的p53和连接于P53的报告蛋白。2.根据I所述的MDM2拮抗剂检验试剂盒，其中，所述p53和所述MDM2的结合通过蛋白质-蛋白质相互作用，所述报告蛋白与P53形成融合蛋白。3.根据I所述的MDM2拮抗剂检验试剂盒，其中，所述载体为树脂，所述树脂优选为亲和树脂，更优选为Ni亲和树脂，所述报告蛋白为荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)。4.根据I所述的MDM2拮抗剂检验试剂盒，其中，MDM2通过标签连接于载体，所述标签优选His标签。5.一种共表达质粒，其特征是MDM2基因和p53基因构建在一个载体中。6.根据权利要求5所述的共表达质粒，其中所述MDM2基因和所述p53基因之间用调控元件间隔开，所述调控元件为终止子和核糖体结合位点。7.根据权利要求5所述的共表达质粒，其中所述MDM2基因可以是全长基因或是包含编码MDM2的17-125位氨基酸的基因，p53基因可以是全长基因或是包含编码p53的15-29位氨基酸的基因。8.根据5-7任一项所述的共表达质粒所表达的蛋白质。9.一种MDM2拮抗剂的检验方法，其特征为向如上述1-4任一项所示的检验试剂盒中加入候选拮抗剂，通过报告蛋白指示拮抗剂导致的MDM2与p53之间的结合变化。10.根据1-4所述的MDM2拮抗剂检验试剂盒和/或5_7所述的共表达质粒和/或8所述的蛋白质在检验MDM2拮抗剂中的用途。具体而言，本专利技术提供MDM2拮抗剂检验试剂盒，其是以离心管为容器，装入载体，然后MDM2通过标签连接到载体上，p53通过蛋白质-蛋白质相互作用结合在MDM2上，报告蛋白融合表达在P53上。其中，绿色荧光蛋白(GFP)是一种新型报告分子，自身即可产生荧光，性质稳定且没有毒副作用。本专利技术还提供MDM2和p53的共表达质粒，具体是MDM2基因和p53基因通过双酶切共同构建在一个载体上，二者之间用调控元件间隔开。本专利技术还提供利用上述载体表达的共表达蛋白，其是将获得的重组载体转化入大肠杆菌中，得到表达菌株，培养重组表达菌株，诱导表达，得到共表达蛋白。通过上述方法获得的本专利技术的MDM2拮抗剂检验试剂盒和相应的MDM2拮抗剂检验方法相对于现有技术中已有的MDM2拮抗剂检验方法，优点在于:I)将MDM2基因与p53基因构建在一个质粒上可以有效控制两个蛋白表达量的比例；2)GFP蛋白可以指示MDM2与p53之间的结合变化，直接可见，不需要添加显色底物；3)克服了现有技术中检测方法的繁琐过程，将MDM2拮抗剂的筛选工作大大简化，能够快速便捷的确定新的候选MDM2拮抗剂的效果。专利技术详沭以下对本专利技术的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本专利技术的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。本专利技术的一个实施方案中，拮抗剂的检验试剂盒为在离心管中装入载体，MDM2连接于载体，p53通过蛋白质-蛋白质相互作用结合在MDM2上，p53连接报告蛋白。应该注意的是，在该实施方案中，MDM2所连接的载体可以但不限于是亲和树脂，优选Ni亲和树脂，其还可以是任何稳定的可以用于生物分子间相互作用的固相介质；MDM2与载体的连接方式可以但不限于使用His标签，还可以是本领域常用的其它标签分子，如GST,或其它形式的连接方式，如范德华力，氢键，共价键等；报告蛋白可以但不限于是GFP和RFP，还可以是其它可以检测或观测到的标记分子；另外，所述报告蛋白与p53的连接方式可以但不限于是融合表达，只要是可以稳固连接所述报告蛋白与P53且不影响两种蛋白本身性质的方式均包含在本专利技术的范围内。在本专利技术的另一个实施方案中，MDM2拮抗剂的检验试剂盒通过共表达质粒来获得，所述共表达质粒为MDM2基因和p53基因构建在一个载体上，具体的，所述MDM2基因和P53基因之间用调控元件间隔开，所述调控元件可以但不限于为终止子和核糖体结合位点，只要所述调控元件能够将两个基因隔开，且能够用于有效控制两个基因表达的调控元件均包含在本专利技术的范围内。在本专利技术的另一个实施方案中，MDM2基因可以是全长或是包含编码全长MDM2的17-125位氨基酸的基因，p53基因可以是全长或是包含编码全长p53的15-29位氨基酸的基因。具体的，P53的15-29位氨基酸和MDM2的17-125位氨基酸是两者结合的关键，因此，应该注意的是，本专利技术中共表达载体所表达的片段含有P53的15-29位氨基酸和MDM2的17-125位氨基酸片段时，可以形成有效的结合，相应的，本专利技术的MDM2拮抗剂检验试剂盒可以借此实现以检验候选MDM2拮抗剂。在本专利技术的另一个实施方案中，共表达质粒表达的蛋白至少包含带有标签的MD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MDM2拮抗剂检验试剂盒，包含连接于载体的MDM2，结合于MDM2上的p53和连接于p53的报告蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董志强，刘扬中，陈思明，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34