本发明专利技术提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架能够促进细胞生长并且适用于三维组织培养和工程化。本发明专利技术还提供用于制备和降解所述中和的葡甘聚糖支架的方法。本发明专利技术进一步提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述葡甘聚糖支架能够促进细胞生长并且适用于三维组织培养和工程化。本专利技术还提供用于制备和降解所述中和的葡甘聚糖支架的方法。本专利技术进一步提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法。【专利说明】用于三维组织培养和工程化的葡甘聚糖支架相关申请的交叉引用本申请要求2011年11月29日提交的美国临时申请号61/564，553的优先权，所述申请出于所有目的整体并入本文。专利技术背景用以修复受损或病变组织(如心脏、骨骼、肝脏、角膜和皮肤)的工程生物材料是再生医学中的活跃研究分支。正在研究的一种方法是使用与促进细胞生长和分化的生物材料构建体或支架结合的细胞，以在体外产生可以移植的功能性组织。仿真细胞外微环境的关键物理特征和分子特征的三维(3D)组织培养系统为组织工程提供了巨大优势。生物材料可以是天然来源的，如基于蛋白质和多糖的生物材料；或可以是合成的，例如基于聚合物、肽和陶瓷的生物材料。针对用于临床组织工程的这些生物材料的设计和开发，需要对如免疫原性、生物降解性、生物相容性、易于修饰和通透性的特性进行严格的探索。高孔隙率和足够的孔径对于细胞接种以及细胞和营养物质的扩散尤其重要。天然生物材料(如胶原蛋白、藻酸盐和壳聚糖)的易获得性和生物相容性已经使得这些天然生物材料成为3D组织培养的有吸引力的基底。然而，不一致的机械特性和所接种细胞的行为所带来的挑战限制了其临床应用。对于骨工程，已经证明支架的孔隙率和孔径是关键因素。先前研究已表明较大孔隙(约200-300 μ m)产生可促进离子/气体交换、蛋白质吸附以及骨磷灰石矿化的较大表面积(Karageorgiou 等，Biomaterials200526:5474-91 ；Yuan 等，Biomaterialsl99920:1799-806)。同时认为较大的孔径对于血管化植入物以及模拟天然骨骼的皮质表面和松质内部是必需的(Karageorgiou等，Biomaterials200526:5474-91)。因此，存在对于可以接种骨细胞并且用于骨再生的、具有大孔隙的支架的需要。葡甘聚糖是一种天然来源的多糖，所述多糖由1:1.6比率的β_1，4连接的D-葡萄糖与D-甘露糖组成,并且大约每11个残基就带有支链(Alonso-Sande等，Eur J PharmBiopharm.200972:453-62)。葡甘聚糖具有含大约5% -10%取代的乙酰基的主链，所述乙酰基参与提供溶解性的氢键合和疏水相互作用。乙酰基在碱的存在下的水解降低葡甘聚糖的溶解性，并且导致聚集，随后形成凝胶。由于葡甘聚糖的胶凝特性和生物降解特性以及其成形为膜、珠粒和水凝胶的延展性，其通常作为乳化剂或增稠剂用在食物中，并且正在针对生物制药应用进行研究。已经开发出用于DNA和药物释放的基于葡甘聚糖的珠粒、微粒和纳米粒子(Liu 等，Drug Deliv.200714:397-402 ;Wang 等，Int J Pharm.2002244:117-26 ；Wen等，Int J Biol Macromol.200842:256-63)，其中没有观察到口服毒性、皮肤致敏、肠毒性、胚胎毒性或细胞衰老的明显迹象(Konishi等，Jpn J Exp Med.198454:139-42)。近期已经对葡甘聚糖作为用于软骨细胞培养的复合支架和用于软骨再生的可注射支架进行了研究(Kondo等,J Tissue Eng Regen Med.20093:361-7)。此研究导致魔芋葡甘聚糖/透明质酸水凝胶的产生，其中对细胞进行培养并允许其作为凝胶中的悬浮物凝集。然而，仍然有待于对开发葡甘聚糖作为用于组织工程化应用的多孔支架进行探索。令人惊奇地是，本专利技术提供一种葡甘聚糖微孔基质，其能够促进细胞生长，并且可用作用于3D细胞培养和组织工程化、以及体内组织再生(例如骨再生)的新型生物材料支架。专利技术概述已经发现当中和碱性葡甘聚糖支架时，所得到的中和葡甘聚糖支架可用作用于三维(3D)细胞培养和组织工程化的基质。中和的葡甘聚糖支架具有适合有效的细胞生长的pH,以及可以允许氧、营养物质、表达的产物和细胞废物扩散的多孔结构。此外，本专利技术的中和的葡甘聚糖支架可以进行表面修饰以促进细胞粘附和增殖。这种天然来源的生物材料支架是热稳定的、无毒的和可生物降解的，并且可模拟广泛范围的细胞类型(如成骨细胞、肝细胞、淋巴细胞和干细胞)的天然三维微环境。在其它实施方案中，本专利技术提供一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成PH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。在一个实施方案中，本专利技术提供一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括使PH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在真空压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备中和的葡甘聚糖支架。在另一个实施方案中，本专利技术提供一种在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞的方法，所述方法包括加热本专利技术的中和的葡甘聚糖支架和细胞的反应混合物，以使细胞繁殖，由此在中和的葡甘聚糖支架上培养细胞。在另一个实施方案中，本专利技术提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通过使pH大于约8 的碱性葡甘聚糖支架与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备。在另一个实施方案中，本专利技术提供一种中和的葡甘聚糖支架，所述中和的葡甘聚糖支架通过使PH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成PH为约7的中和的葡甘聚糖支架来制备，其中碱性葡甘聚糖支架包含细胞粘附促进剂。在另一个实施方案中，本专利技术提供一种降解本专利技术的中和的葡甘聚糖支架的方法，其通过使中和的葡甘聚糖支架与降解剂接触来实现。附图简述图1示出葡甘聚糖支架和人间充质干细胞(hMSC)的扫描电子显微照片(表面拓扑)，其示出水升华后葡甘聚糖凝胶的表面(A)和内部结构(B)，以及接种在葡甘聚糖支架上的 hMSC (C、D)。图2示出聚-L-赖氨酸(PLL)对hMSC的粘附的影响。在胶凝之前将PLL添加至葡甘聚糖混合物中。与对照相比，hMSC对所得到的支架显示出显著较大的附着(p〈0.05)。图3a和图3b示出在葡甘聚糖支架中培养的hMSC的生物发光。将表达萤火虫荧光素酶的hMSC接种到对照或PLL处理的葡甘聚糖支架上并且每周成像。经过一段时间，在对照支架中培养的细胞显示出生物发光水平的增加。然而，在葡甘聚糖支架中培养的hMSC局限于接种部位，并且没有显示出生物发光的增加。图4示出葡甘聚糖支架中的hMSC的组织学。在葡甘聚糖支架中培养的hMSC用苏木精和曙红染色。在细胞接种之前的葡甘聚糖支架显示出遍布的多孔结构(A)0接种后，细胞显示出不同的形态并且形成为结构(B-D) (IOx放大倍数)。图5示出波形蛋白和细胞角蛋白的表达。在培养板上培养的所有hMSC均显示出强烈的波形蛋白(B)表达而无细胞角蛋白(A)表达。接种在葡甘聚糖支架上的细胞显示出波形蛋白表达(D，C=同种型对照)。不规则形状的内腔周围的细胞显示出强烈的细胞角蛋白表达，并且衬在这些内腔上的扁平细胞表达波形蛋白和细胞角蛋白(E、F)。图6示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备中和的葡甘聚糖支架的方法，所述方法包括：使pH大于约8的碱性葡甘聚糖支架在大于或约等于大气压的压力下与水溶液接触，以形成pH为约7的中和的葡甘聚糖支架，由此制备所述中和的葡甘聚糖支架。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·畅·I·李，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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