鱼鳃组织石蜡切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括固定、脱钙、脱水、透明、石蜡渗透、包埋、切片、黏片和展片、脱蜡复水、染色、复染和封固等步骤。本发明专利技术较现有石蜡切片制作方法改进了脱水、透明、浸蜡的操作过程，提高了鱼鳃组织石蜡制备固定和组织浸蜡的效果，提高了鱼鳃组织石蜡切片制备时的切片问题，极大地提高了鱼鳃组织切片的结构清晰度，解决了现有技术在鱼鳃组织制作过程中存在的若干问题。利于免疫细胞化学染色的抗原定位，因而在鱼鳃组织切片上进行原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光等实验可以显示某些基因和蛋白的组织分布和细胞定位，为进一步从细胞、基因和蛋白水平上进行鱼鳃研究提供了切实可行的条件。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括固定、脱钙、脱水、透明、石蜡渗透、包埋、切片、黏片和展片、脱蜡复水、染色、复染和封固等步骤。本专利技术较现有石蜡切片制作方法改进了脱水、透明、浸蜡的操作过程，提高了鱼鳃组织石蜡制备固定和组织浸蜡的效果，提高了鱼鳃组织石蜡切片制备时的切片问题，极大地提高了鱼鳃组织切片的结构清晰度，解决了现有技术在鱼鳃组织制作过程中存在的若干问题。利于免疫细胞化学染色的抗原定位，因而在鱼鳃组织切片上进行原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光等实验可以显示某些基因和蛋白的组织分布和细胞定位，为进一步从细胞、基因和蛋白水平上进行鱼鳃研究提供了切实可行的条件。【专利说明】
本专利技术属于显微组织切片领域，具体涉及一种。
技术介绍
石腊切片(paraffin section)是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。其基本过程包括:固定、脱水、透明、渗蜡、包埋、切片、展片、黏片、烤片、脱蜡复水、染色和封固等多个步骤。硬骨鱼类的鱼觸具有五对觸弓，前四对具有2列细长的觸瓣,其基本通过觸间膜联结，许多鱼种的鳃弓前侧列生着鳃耙。鳃瓣的两侧有许多半圆形的二级鳃瓣，其上面由上皮细胞构成单层的扁平上皮，并由柱状细胞间隔着，平行分布许多毛细血管。由于鱼鳃组织结构的特殊性，采用传统的石蜡切片制作方法，很难得到理想的效果，不仅结构模糊，而且细胞核与细胞浆染色对比不明显，层次不清，着色不良，导致组织标本的制作失败。因此，如何对现有石蜡切片制备方法进行改进，解决鱼鳃组织切片制备过程中存在的问题，是本领域亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的不足，提供了一种鱼鳃组织切片的制备方法，该制备方法可以保证鱼鳃组织和细胞结构完整，位置相对固定，并且简单、高效，适用于鱼鳃组织切片的快速大规模制备。为实现上述目的，本项专利技术采用了如下技术方案。本专利技术的鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括步骤如下: (1)固定将鱼觸组织剪成3mmX 3 mmX2 mm的小块浸泡于Bouin’s溶液中进行固定，室温条件下固定24 h，期间换Bouin’ s溶液2?3次； (2)脱钙将(I)处理的材料流水冲洗24h，然后浸入Perenyi ’ s脱钙液中，室温条件下保持5 d ； (3)脱水将(2)处理后的材料依次浸入上行梯度乙醇脱水，步骤依次是:60%乙醇浸泡0.5 h，70%乙醇浸泡0.5 h，80%乙醇浸泡0.5 h,90%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡I h，95%乙醇浸泡2 h,无水乙醇浸泡40 min,无水乙醇浸泡40 min ； (4)透明将(3)处理好材料依次浸入二甲苯浸泡15min、二甲苯浸泡15 min ； (5)石蜡渗透将经(4)处理好材料浸入二甲苯与石蜡按体积比1:1的溶液中浸泡30min,然后转移到56°C的石腊中渗透4 h ； (6)包埋将牛皮纸折成小纸盒，先将加温溶解的石蜡倒入纸盒中，然后迅速将经(5)处理好材料切面朝下、鳃瓣与切面平行摆放在纸盒中，冷却成型； (7)切片将(6)包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为5飞μ m ; (8)展片和黏片将(7)切好的蜡带分割呈适宜的片段，放在5(T55°C的蒸馏水面，观察到切片充分扩展时，迅速用涂有黏片液的载玻片将切片捞取，将切片控制在载玻片的最佳观察位置，将玻片放在40°C的恒温箱烤片12 h，烤干后的切片贴上标签或记号，放到玻片收藏盒内； (9)脱蜡复水将(8)处理后切片脱蜡，依次浸泡在二甲苯两次，每次均为5min，然后进行下行梯度乙醇复水，依次浸泡在无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇3 min>70%乙醇5 min,然后用清水冲洗5 min、蒸懼水冲洗I min ； (10)染色将经过(8)处理的切片放入苏木精中染色15min，用自来水冲洗Is后，放入体积百分比为1%的盐酸乙醇溶液中分化退色Is ； (11)复染将(9)处理的切片放入自来水流水中漂洗10min、蒸馏水冲洗Is后，经过伊红乙醇溶液复染I min，然后蒸馏水漂洗1-5 s ;最后经过75%乙醇荡洗1_5 s、95%乙醇冲洗I min、无水乙醇冲洗I min、无水乙醇冲洗I min、二甲苯冲洗3 min、二甲苯冲洗3 min ； (12)封固在经(10)处理的切片上滴2-3滴的加拿大树脂后，迅速将盖玻片小心盖上，不能产生气泡，若有气泡要挤压出来，然后将封片在室温下自然干燥即可。所述的Bouin’s固定液是由下列试剂按体积比配制而成:饱和苦味酸15份，福尔马林5份，冰醋酸I份。所述的Perenyi ’ s脱钙液是由下列试剂按体积份配制而成:10%硝酸4份，0.5%铬酸3份，无水乙醇3份。所述的石蜡是指熔点为56?58°C的鳞片状切片石蜡。本专利技术方法中，鱼鳃组织经过苏木精-伊红染色，最后用加拿大树胶封片，所制备的组织切片在显微镜下观察，然后记录、拍照。对鱼鳃组织和细胞的形态结构进行观察，以形成清晰、明了的鱼鳃组织切片图。与现有技术相比，本专利技术的优点在于: (I)极大地提高了鱼鳃组织石蜡制备固定的效果本专利技术采用Bouin’ s固定液室温固定，增强了对组织的渗透能力，使细胞各个组分得到充分的沉淀和凝固，避免由于材料长时间浸泡而发生的肿胀、变硬等破坏，从而能完整地保存细胞生存时的形态结构，获得较好的染色和观察效果。(2)极大地提高了鱼鳃组织石蜡切片制备时的切片问题本专利技术采用Perenyi’ s液作为脱钙液，鱼鳃由于含有骨质结构，如果不进行脱钙处理，切片时会比较硬，不好切片，用本专利技术制备的切片，不仅切片效果良好，而且细胞核和细胞浆细微结构着色均好。(3)极大地提高了组织浸蜡的效果本专利技术在浸透过程中加入了二甲苯与石蜡混合剂的过程，加速了石蜡渗透进入组织的时间，可以使石蜡充分渗透组织，包埋效果良好。本专利技术较传统石蜡切片制作方法，改进了常规的脱水、透明、浸蜡的操作过程，极大地提高了鱼鳃组织切片的结构清晰度，解决了鱼鳃组织在制作过程中存在的问题，利于免疫细胞化学染色的抗原定位，因而在鱼觸组织切片上进行原位杂交、免疫组织化学及免疫荧光等实验可以显示某些基因和蛋白的组织分布和细胞定位，为进一步从细胞、基因和蛋白水平上进行鱼鳃相关研究提供了切实可行的条件。下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1 实验目的:通过制备鱼鳃组织石蜡切片，观察不同浓度氟化物暴露90 d后鲤鱼鳃组织的病理学变化。具体步骤如下: (I)制备或选购使用试剂 A制备Bouin’s固定液由下列试剂按体积比配制而成:饱和苦味酸1本文档来自技高网...

【技术保护点】
鱼鳃组织石蜡切片的制作方法，包括步骤如下：（1） 固定 将鱼鳃组织剪成3 mm×3 mm×2 mm的小块浸泡于Bouin’s溶液中进行固定，室温条件下固定24 h，期间换Bouin’s溶液2~3次； （2）脱钙 将（1）处理的材料流水冲洗24 h，然后浸入Perenyi’s脱钙液中，室温条件下保持5 d；（3）脱水 将（2）处理后的材料依次浸入上行梯度乙醇脱水，步骤依次是：60% 乙醇浸泡0.5 h，70% 乙醇浸泡0.5 h，80%乙醇浸泡0.5 h，90% 乙醇浸泡1 h，95% 乙醇浸泡1 h，95% 乙醇浸泡2 h，无水乙醇浸泡40 min，无水乙醇浸泡40 min；(4) 透明 将（3）处理好材料依次浸入二甲苯浸泡15 min、二甲苯浸泡15 min；（5）石蜡渗透 将经（4）处理好材料浸入二甲苯与石蜡按体积比1:1的溶液中浸泡30 min，然后转移到56℃的石蜡中渗透4 h；（6）包埋  将牛皮纸折成小纸盒，先将加温溶解的石蜡倒入纸盒中，然后迅速将经（5）处理好材料切面朝下、鳃瓣与切面平行摆放在纸盒中，冷却成型；(7) 切片 将（6）包埋好的石蜡块经过分割、修整与固着，然后经切片机将石蜡块切成连续的蜡带，蜡带形状为长方形，上下两个长边平行，切片厚度为5~6μm；（8）展片和黏片 将（7）切好的蜡带分割呈适宜的片段，放在50~55℃的蒸馏水面，观察到切片充分扩展时，迅速用涂有黏片液的载玻片将切片捞取，将切片控制在载玻片的最佳观察位置，将玻片放在40℃的恒温箱烤片12 h，烤干后的切片贴上标签或记号，放到玻片收藏盒内；（9）脱蜡复水 将(8)处理后切片脱蜡，依次浸泡在二甲苯两次，每次均为5 min，然后进行下行梯度乙醇复水，依次浸泡在无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇3 min、70%乙醇5 min，然后用清水冲洗5 min、蒸馏水冲洗1 min；（10）染色 将经过（8）处理的切片放入苏木精中染色15 min，用自来水冲洗1s后，放入体积百分比为1%的盐酸乙醇溶液中分化退色1s；（11）复染 将（9）处理的切片放入自来水流水中漂洗10 min、蒸馏水冲洗1s后，经过伊红乙醇溶液复染1 min，然后蒸馏水漂洗1‑5 s；最后经过75%乙醇荡洗1‑5 s、95%乙醇冲洗1 min、无水乙醇冲洗1 min、无水乙醇冲洗1 min、二甲苯冲洗3 min、二甲苯冲洗3 min；（12）封固 在经（10）处理的切片上滴2‑3滴的加拿大树脂后，迅速将盖玻片小心盖上，不能产生气泡，若有气泡要挤压出来，然后将封片在室温下自然干燥即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹谨玲，陈剑杰，罗永巨，王俊东，李宏全，宋晶，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西;14