本发明专利技术提供了一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法，通过将试验动物的褐色脂肪组织用提取液A混合研磨，离心去上层脂肪，取一次上清液；将所述一次上清液离心去沉淀，取二次上清液；将二次上清液离心取一次沉淀，将一次沉淀与提取液B混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液离心取二次沉淀；将二次沉淀与提取液B混匀，加入TritonX-100混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在离心取三次上清液；将三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白-1。本发明专利技术的纯化效果较好，成本低，非常适合实验室采用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白分离纯化
，尤其涉及。
技术介绍
研究指出解偶联蛋白-1(UCPl)的一级结构由306个氨基酸残基构成，具有6个由α -螺旋构成的疏水环的过渡区域。UCPl分子的末端位于线粒体内膜的外表面，并且具有一个核苷酸结合位点。后来，有人深入地研究了 UCPl分子上核苷酸结合位点的结构状况，结果表明，UCPl的核苷酸结合位点可能位于由UCPl分子构成的一个亲水通道上。通过核磁共振(NMR)和圆二色性分析，发现残基263~268位置正好具有一个α -螺旋结构，它是第六跨膜域的N-末端。若在结构或区域定向上发生改变，则会导致核苷酸或脂肪酸调节以及转运活性功能改变。有研究报道BAT线粒体UCPl的261~269区域在控制质子转移活动中具有重要作用，若残基Phe257-Lys268-Gly269缺失则导致蛋白质的核苷酸调节功能丧失，而且如果这个片断完全缺失，则会导致膜穿孔。用单链构象多态性检测(SSCP)和序列分析检测UCPl基因中的突变，结果表明有四个预期的氨基酸突变被检测到，即Arg40Trp (外显子l)，Lys257Arg (外显子5)，它们的发生频率较低，而Ala64Thr (外显子2)与Met229Leu(外显子5)突变发生频率则较高。采用2-叠氮ATP分解结果则显示出ATP的结合位点位于UCPl分子C-末端的第三个氨基酸残基上；核苷酸(GDP)结合位点位于第258和279号氨基酸残基。这四个突变在瘦人中的出现频率普遍比肥胖人低，因而这些UCPl基因突变可能与肥胖发生有关。另外，冷刺激能使褐色脂肪细胞膜上的肾上腺素受体被神经突触释放的儿茶酚胺类物质激活，造成脂肪动员，激活UCP1。UCPl引起线粒体氧化呼吸的电子传递和ATP产生解偶联作用，从而降低脂肪酸氧化代谢的产能效率，大量能量以热能的形式散发，经过BAT丰富的血管被输送到身体的各个部分。国内现有的蛋白纯化技术多为使用蛋白纯化试剂盒，该方法方便快捷，但对试剂要求较高，且成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，旨在解决解偶联蛋白-1分离纯化过程比较繁琐，每次纯化的量较小的问题。本专利技术是这样实现的，，包括以下步骤:( I)采集试验动物的褐色脂肪组织，将所述褐色脂肪组织与提取液A按质量体积比为Ig:5ml混合研磨，在1500g、4°C条件下离心10min,去掉上层脂肪,取一次上清液；将所述一次上清液在500g、4°C条件下离心5min去掉沉淀,取二次上清液；(2)将所述二次上清液在10000g、4°C条件下离心10min，取一次沉淀，将所述一次沉淀与提取液B按质量体积比为Ig:5ml混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4°C条件下离心30min，取二次沉淀；(3)将所述二次沉淀与提取液B按质量体积比为Ig:2.5ml混匀，加入与步骤(2)所述提取液B等体积的体积浓度为5%的TritonX-1OO混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4°C条件下离心30min离心，取三次上清液；(4)将所述三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白-1 ； 在上述步骤中，所述提取液A的ρΗ7.4,包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L鹿糖以及 2mmol/LEDTA ;所述提取液 B 的 pH6.7，包括 20mmoI/LMOPS、20mmoI/LNa2SO4 以及 2mmol/LEDTA。优选地，在步骤(2)以及(3)中，所述20kHz条件下超声处理为在20kHz条件下超声两次，每次25s。优选地，在步骤(1)中，所述采集试验动物的褐色脂肪组织包括以下步骤:A、将中緬树駒断颈处死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛间及颈部两侧的毛发，用解剖剪和镊子迅速剪下肩胛间及颈部两侧的褐色脂肪组织，去除上面的白色脂肪组织；B、将所述褐色脂肪组织用提取液A按质量体积比为Ig:3ml混匀清洗组织，去除组织上的毛发。优选地，在步骤(4)中，所述将所述三次上清液装柱、洗脱纯化包括以下步骤:A、取0.1~0.3g羟磷灰石溶于双蒸水中，装层析柱，保持柱面平整，静置30~40min ；B、取I~1.5ml所述三次上清液上样，用提取液B进行洗脱；C、用收集器收集柱不吸附成分，得到解偶联蛋白-1。本专利技术克服现有技术的不足，提供，通过将试验动物的褐色脂肪组织用提取液A混合研磨，离心去上层脂肪，取一次上清液；将所述一次上清液离心去沉淀，取二次上清液；将二次上清液离心取一次沉淀，将一次沉淀与提取液B混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液离心取二次沉淀；将二次沉淀与提取液B混匀，加入TritonX-1OO混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在离心取三次上清液；将三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白-1。本专利技术的的纯化效果较好，成本低，非常适合实验室采用。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。[0021 ] 实施例1褐色脂肪组织中线粒体粗蛋白的分离(I)将实验动物(中緬树駒)断颈处死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛间及颈部两侧的毛发，用解剖剪和镊子迅速剪下肩胛间及颈部两侧的褐色脂肪组织，小心去除上面带有的白色脂肪组并称重；(2)将组织放入研钵中，用3倍体积(W:V)的提取液A (包含lOmmol/LTrisbase、250mmol/L蔗糖以及2mmol/LEDTA，pH7.4)清洗组织，仔细去除组织上的毛发(此步骤可重复I~2次)；(3)在冰上快速剪碎组织，以褐色脂肪组织:提取液A=l:5 (W:V)加入5倍体积的提取液A，混匀后迅速匀浆(研磨一定要充分，提取液A可分作2~3次加入研钵)；(4)将匀浆液转移到1.5ml离心管中，在1500g、4°C条件下离心10min，用移液器小心去掉上层脂肪，取一次上清液；然后在500g、4°C条件下离心5min，去掉沉淀，取二次上清液；(5)将二次上清液进一步在10000g、4°C条件下离心10min,去掉上清液,取一次沉淀，将所得的一次沉淀用提取液 B (W: V=1: 5)(包含:20mmol/LM0PS，20mmol/LNa2S04, 2mmol/LEDTA, pH6.7)悬浮，充分混匀。(6)用超声波仪在20kHz条件下超声两次，每次25s ；(7)超声后的溶液在10000g、4°C条件下离心30min，去掉上清液，取二次沉淀；(8)用1/2初始体积的提取液B悬浮二次沉定，同时加入等体积5%的TritonX-100，充分混匀， 20kHz条件下超声两次，每次30s。(9)将超声后的溶液于10000g，4°C条件下离心30min，取三次上清液，此三次上清液为褐色脂肪组织中线粒体粗蛋白。[0031 ] 实施例2褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1的纯化(I)取0.1~0.3g的羟磷灰石溶于双蒸水中，装层析柱，柱面一定要平整，然后静置 30 ~40min ；(2)用上述上清液粗蛋白上样(上样量为I~1.5ml)，用适量体积的提取液B进行洗脱；(3)用DBS2100电脑全自动部分收集器(上海康华生化仪器制造厂)收集柱本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白‑1分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）采集试验动物的褐色脂肪组织，将所述褐色脂肪组织与提取液A按质量体积比为1g：5ml混合研磨，在1500g、4℃条件下离心10min，去掉上层脂肪，取一次上清液；将所述一次上清液在500g、4℃条件下离心5min去掉沉淀，取二次上清液；（2）将所述二次上清液在10000g、4℃条件下离心10min，取一次沉淀，将所述一次沉淀与提取液B按质量浓度为1：5混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4℃条件下离心30min，取二次沉淀；（3）将所述二次沉淀与提取液B按质量体积比为1g：2.5ml混匀，加入与步骤（2）所述提取液B等体积的体积浓度为5%的TritonX‑100混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4℃条件下离心30min离心，取三次上清液；（4）将所述三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白‑1；在上述步骤中，所述提取液A的pH7.4，包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L蔗糖以及2mmol/LEDTA；所述提取液B的pH6.7，包括20mmol/LMOPS、20mmol/LNa2SO4以及2mmol/LEDTA。...
【技术特征摘要】
1.一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)采集试验动物的褐色脂肪组织，将所述褐色脂肪组织与提取液A按质量体积比为Ig:5ml混合研磨,在1500g、4°C条件下离心10min,去掉上层脂肪,取一次上清液；将所述一次上清液在500g、4°C条件下离心5min去掉沉淀，取二次上清液； (2)将所述二次上清液在10000g、4°C条件下离心10min,取一次沉淀,将所述一次沉淀与提取液B按质量浓度为1:5混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4°C条件下离心30min，取二次沉淀； (3)将所述二次沉淀与提取液B按质量体积比为Ig:2.5ml混匀，加入与步骤(2)所述提取液B等体积的体积浓度为5%的TritonX-1OO混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4°C条件下离心30min离心，取三次上清液； (4)将所述三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白-1； 在上述步骤中，所述提取液A的pH7.4,包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L鹿糖以及 2mmol/LEDTA ;所述提取液 B 的 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱万龙，王政昆，张浩，高文荣，郑佳，孙舒然，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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