转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、环引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、阳性DNA对照和阴性DNA对照，试剂盒还可以含有显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化或直接观察反应管内沉淀的浊度变化等方法，判断样品是否含有cry3A基因成分。本发明专利技术不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因植物中cit3A基因的引物组、试剂盒和检测方法。
技术介绍
2013年全球转基因作物种植面积高达1.752亿公顷，比1996年商业化初期增长了 100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫、抗除草剂。在抗虫转基因植物中应用的目的基因有crylAb、crylAc、crylA.105、crylF、cry2Ab> cry3A > cry3Bb^ vip3'等,其中ciyJA基因存在于转基因玉米MIR604中，已获准在美国、欧盟、澳大利亚、俄罗斯、韩国、南非等近20个国家和地区商业化种植或作为食品和饲料，我国也在2008年批准转基因玉米MIR604进口用作加工原料。为加强转基因生物及其产品的安全管理，全球50多个国家和地区制订了转基因生物标识制度。我国于2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及安全评价、标识管理、进口安全、加工审批等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，要求对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种产品实施强制性标识管理制度。转基因检测技术是转基因生物安全管理的重要技术支撑。目前转基因检测技术主要分为两大类:一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，PCR方法应用最为广泛，但基于PCR技术的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3~4 h)，难以实现现场快速检测，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是:①恒温扩增:整个扩增反应在恒温条件(6(T65°C)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效:整个扩增和产物检测可在I h内完成；③高特异性:针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度:检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便:扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中cir3A基因的检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组。 本专利技术的另一个目的在于公开一种转基因植物中CirM基因的LAMP检测试剂盒。本专利技术的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中cry3A基因的LAMP检测方法。本专利技术所采用的技术方案如下: 根据CIT.3A基因的核苷酸序列，设计CIT.3A基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: f 5 ;确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。转基因植物中CiySA基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物，其核苷酸序列分别如下所示:外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:1);外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2);内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4);环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。转基因植物中ciy3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物I和内引物2的浓度依次为4飞Mmol/L、r6 Mmol/L、32~48 Mmol/L和32~48Mmol/L ； (2)环引物溶液:环引物浓度为16~24Mmol/L ； (3)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7~9U/ μ L ;(4)IOX 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊； (5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ； (7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA。优选的，所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40Mmol/L内引物1、40 Mmol/L内引物2。优选的，所述的环引物溶液中含有20 Mmol/L环引物。优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L0优选的，所述的10Χ反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L和8mol/L。本专利技术的CIT3A基因的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为SYBRGREEN I荧光染料。利用以上所述的试剂盒检测基因的方法，包括如下步骤: (1)提取待测 样品的基因组DNA:按常规CTAB方法或植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA ； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L PCR反应管内加入模板DNA 2^5UL、检测引物溶液1.5 yL、环引物溶液I yL、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反应缓冲液2.5μ L、dNTPs溶液3 μ L,用灭菌去离子水补齐到25 μ L ； (3)配制对照样品的LAMP检测反应体系:配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2) —致； (4)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育3(T60min，80°C孵育5min终止反应； (5)LAMP扩增结果的鉴定:通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取2~5 PL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。在试剂盒中含有显色剂的情况下，在步骤(4)后获得的LAMP扩增产物中加入1~ 2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。通过实验证明，本专利技术提供的基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点。【附图说明】[0021 ] 图1为实施例1的LAMP检测结果图，I为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品； 图2为实施例2的LAMP检测结果图，I为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品；本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示：外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）。

【技术特征摘要】
1.转基因植物中基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示:外引物 1:AAGCCCCACCTGTTCGA (SEQ ID NO:I)；外引物 2:GGCTCGCTGCTCTTGTTG (SEQ ID NO:2)；内引物 1:AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC (SEQ ID NO:3);内引物 2:GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA (SEQ ID NO:4); 环引物:GGGCTGGAAACGCGTGT (SEQ ID NO:5)。2.转基因植物中ciy3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由权利要求1所述的2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物I和内引物2的浓度依次为4飞Mmol/L,r6 Mmol/L、32~48Mmol/L和 32~48 Mmol/L ； (2)环引物溶液:由权利要求1所述的环引物配制而成，环引物的浓度为16~24Mmol/L ； (3)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7~9U/ μ L ; (4)IOX 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4) 2S04,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜喊； (5)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (6)阳性DNA对照样品，转基因植物的基因组DNA，或含有基因序列的大肠杆菌质粒DNA ； (7)阴性DNA对照样品:不含ciy3A基因序列的DNA。3.根据权利要求2所述的CirJA基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L外引物1、5 Mmol/L外引物2、40 Mmol/L内引物1、40 μ mol/L内引物2。4.根据权利要求2所述的CirJA基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的环引物溶液中含有20 Mmol/L环引物。5.根据权利要求2所述的cit3A基因的LAMP检测试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李飞武，闫伟，李葱葱，龙丽坤，董立明，邢珍娟，夏蔚，邵改革，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林;22