本发明专利技术公开了一种快速、灵敏、操作简便的头孢氨苄残留量的荧光免疫层析检测试纸条及其制备，该试纸条包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线和质控线，结合垫上涂覆有荧光标记的头孢氨苄单克隆抗体。该头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法包括：头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原的合成，羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备，而后包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备，后涂覆于玻璃纤维上作为结合垫；在背板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；得到的试纸条切割成4mm宽度于常温保存。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种快速、灵敏、操作简便的头孢氨苄残留量的荧光免疫层析检测试纸条及其制备，该试纸条包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线和质控线，结合垫上涂覆有荧光标记的头孢氨苄单克隆抗体。该头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法包括：头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原的合成，羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备，而后包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备，后涂覆于玻璃纤维上作为结合垫；在背板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；得到的试纸条切割成4mm宽度于常温保存。【专利说明】头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条及其制备
本专利技术涉及一种兽药残留的荧光免疫速测技术，特别是涉及一种用于头孢氨苄残留检测的荧光免疫层析检测试纸条及其制备。
技术介绍
头孢氨苄(Cephalexin)是β-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害。针对该药物在食品中的残留，我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，牛奶中的最大残留限量为100 μ g/kg，肌肉、脂肪中的最大残留限量为200μ g/kg。目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检测。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为突光抗体技术(fluorescent antibody technique)。用突光抗体示踪或检查相应抗原的方法称突光抗体法；用己知的突光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，其中又以荧光抗体方法较常用。基于免疫荧光技术，同时结合色谱层析原理的分析方法称为荧光免疫层析法，以其具有灵敏、快速、特异、简便等优点，广泛应用于现场监控和大规模样品筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查，用于检测牛奶中头孢氨苄药物残留量的荧光免疫层析检测试纸条。本专利技术所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫制成头孢氨苄残留荧光免疫定量层析试纸条。优选地，所述结合垫上涂覆的稀土荧光纳米颗粒的直径范围为50_100nm。所述稀土荧光纳米颗粒，可以发射的波长范围是600_630nm，荧光纳米颗粒含有稀土络合物，在基态下是稳定的，在激发光源(340-365nm)的作用下能够发射出波长范围在600-630nm 的荧光。优选地,所述结合垫上涂覆的突光纳米颗粒标记抗体为稀土突光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体，硝酸纤维素膜上面包被有检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原。本专利技术的另一目的在于提供一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法。本专利技术所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤:A.头孢氨苄单克隆抗体的具体制备过程为:(I)动物免疫:采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白蛋白偶联物为免疫原；(2)细胞融合与克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3)单克隆抗体的制备与纯化:使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株IO6个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，_20°C保存。B.荧光纳米颗粒的醛基化:取2mg荧光纳米颗粒(20mg/mL，100 μ L)，以25mM的碳酸盐缓冲液(pH = 9.5)洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后悬浮于100 μ L上述碳酸盐缓冲液中。加入120 μ L醛基化的葡聚糖，混匀，短时超声，避光反应3-4小时(室温)。以上述碳酸盐缓冲液洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后，悬浮于100 μ L碳酸盐缓冲液中。1500r/min离心I分钟，去除杂质，放置在4 °C备标记抗体之用。C.荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备:将0.5mg头孢氨苄单克隆抗体用碳酸盐缓冲液4°C透析过夜，与上述醛基化的荧光纳米颗粒混合，4°C反应过夜。然后，加入硼氰化钠，终浓度为5mM，4°C反应2-4小时。再加入等体积的封闭液(50mM tris-HClpH7.8，含2% BSA、4%蔗糖)，封闭12小时或过夜；最后用50mM tris-HCl ρΗ7.8洗涤标记好的抗体3遍(12000r/min，4分钟，4°C )，然后用100 μ L50mM tris-HCl ρΗ7.8 (含 0.9% NaCl、0.2% BSA、0.05% Tween-20)悬浮，4°C避光储存备用。D.涂覆有突光标记抗体的结合垫:将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/L Tris-HCl (ρΗ7.8), 1.0% TritonX-100，3.0% BSA的处理液中，于4°C条件下浸泡2小时；然后于37°C下烘干2小时，备用。再将玻璃纤维膜切成IOmm的宽度，然后在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头喷到玻璃纤维膜，在37°C下烘干I小时，备用。E.检测线和质控线包被到硝酸纤维素膜上:所述检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原；将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄IOmg溶于5mL PBS (0.0lmol/L，pH7.4)中，加入I %戊二醛溶液搅拌30分钟，取0VA30mg溶于ImL PBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25°C搅拌反应2小时，4°C反应过夜。4°C条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成。分别用包被稀释液将头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3-1.0mg/mL，膜液量为25 μ L/25-30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4-7mm，然后于37°C下烘干2小时，封袋，以备试纸背板贴板之用。F.在背板上一次相互搭接的粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸条，按照要求切割为4mm宽，与干燥剂一起密封备用。本专利技术还提供一种利用所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条检测头孢氨苄残留的方法，包括以下步骤:(I)样品前处理:牛奶样品离心(12000r/min，IOmin)脱脂后直接测定；(2)用试纸条检测:在试纸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线为头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原和质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体。头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条中各部分含有以下成分：A.结合垫，上面涂覆有荧光标记抗体，所述标记抗体为稀土荧光纳米颗粒与头孢氨苄特异性抗体采用化学交联法进行连接得到的偶联物，具体制备过程为：(1)头孢氨苄‑牛血清白蛋白免疫抗原的合成：将头孢氨苄和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亚胺法进行偶联得到免疫抗原。取头孢氨苄15mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入25mg碳二亚胺(EDC)和10mg N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌30分钟，取BSA10mg溶于活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，再4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存；(2)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄‑牛血清白蛋白偶联物为免疫原；(3)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株106个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，‑20℃保存；(5)免疫探针制备：取荧光纳米颗粒用碳酸盐缓冲液pH9.5离心洗涤，悬浮，加入醛基化的葡聚糖反应4h，加入上述头孢氨苄单克隆抗体混合4℃过夜。加入硼氰化钠溶液于4℃反应4h，洗涤、4℃储存，备用。B.硝酸纤维素膜，上面包被有检测线和质控线，检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法进行偶联得到的包被原，质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)，具体制备过程为：(1)头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原的合成：将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄10mg溶于5mLPBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存；(2)羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成；(3)分别用包被稀释液将头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3‑1.0mg/mL，膜液量为25μL/25‑30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4‑7mm，然后于37℃下烘干2小时。C.样品垫，具体处理为：将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/LTris‑HCl(pH7.8)，1.0％TritonX‑100，3.0％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡2小时；然后于37℃下烘干2小时，备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邹明强，张帆，陈艳，胡佳丽，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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