一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用技术

本发明专利技术具体涉及一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用。本发明专利技术筛选获得一种新的非洲帝王蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，由该基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。本发明专利技术还提供了人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：3~4所示，所述抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽对多重耐药性病原菌、革兰氏细菌和真菌具有较强的抗菌活性，其分子量小且具有广谱抗菌机制作用，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，且在低浓度下对人的正常细胞毒性小，是抗生素的最佳替代物。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用
本专利技术属于生物技术及医药领域，具体涉及一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用。
技术介绍
自抗生素问世以来，各种细菌感染性疾病得到了有效的控制。但由于抗生素被滥用或乱用，加速了细菌的进化过程，导致出现了很多耐药性细菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,MRSA)和耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-ResistantEnterococci,VRE)是两种临床上比较常见但又很难控制的耐药菌。在过去三、四十年间，MRSA和VRE已经从可控的耐药菌转变成了严重危害公共健康问题的超级细菌。金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种比较突出的人类病原菌，它能引起一系列的疾病，小到普通的皮肤感染，大到严重危及生命的疾病，如心内膜炎、肺炎、败血症等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是指对β内酰胺类抗生素（如甲氧西林、苯唑西林和氟氯西林）耐药的金黄色葡萄球菌株。自1961年，MRSA在英国首次发现后，其分离率逐年增加，1985年开始爆发流行，已成为医院感染的重要致病菌之一。MRSA多重耐药现象日益严重，部分地区已经出现对万古霉素耐药、中介耐药以及异质性耐药MRSA细菌。研究表明，MRSA从最初的仅存在于医院逐渐蔓延到自然界各个角落，已经成了一个全球性健康问题。研究员已经从家畜（如马、牛、猪等）、宠物（狗）、动物园动物及野生动物（野兔）分离出该病原菌。据报道，全球约有超过16亿人携带葡萄球菌，保守估计携带MRSA的人群大约在200~8500万。2009年，中国CHINET细菌耐药性监测中，得到金葡菌中甲氧西林耐药株MRSA平均为52.17%。在2004年，美国ICU病房，MRSA的分离率达到了66.17%，每年因感染MRSA而死亡的美国人多达18000。在1995年至2003年加拿大医院MRSA的发生率增长了10倍。欧洲最近的一项抗生素耐药检测指出，在2000~2008年，马耳他MRSA引起的菌血症，已经居欧洲之首，2006年最高达到了66%。在地中海地区很多国家，MRSA的感染也已经很严重。而目前市面上对MRSA有作用的抗生素仅万古霉素一种，因此开发新型抗生素类药物极其必要。肠球菌（Enterococci）定植于我们的肠道和皮肤,通常不会引起疾病，一旦它们获得了对抗生素的抗性，就能导致肠道、尿道和伤口等处发生非常严重的感染（如败血症、心内膜炎等）。由于万古霉素的滥用/乱用，耐万古霉素肠球菌(VancomycinresistantEnterococcus,VRE)的数量逐渐增多，且VRE具有将万古霉素耐药性传递到金黄色葡萄球菌的危险。虽然目前临床上使用的抗生素有上百种，还没有一种能有效治疗VRE的药物，临床上常用几种抗生素结合使用的方法来治疗VRE引起的感染，如用替考拉宁等糖肽类抗生素与青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素结合使用。糖肽类抗生素的作用机制与β-内酰胺类抗生素相同，都是干扰细菌细胞壁肽聚糖的交联，从而使细菌细胞发生裂解。抗生素类药物由于需要与细胞上特异性受体结合，从而干扰或破坏细菌体内的某个生理过程来抑制细菌的生长，故容易引起微生物的抗药性，加速微生物进化，从而产生超级细菌。抗菌肽普遍存在于各种生物体，是生物体先天免疫系统的重要组成部分。这类多肽由10-50个氨基酸组成，带有不同数量的正电荷。这些抗菌肽通过所带的正电荷与细菌细胞壁膜的磷脂的负电荷相吸引，在细胞膜上形成孔道，导致细胞质流出，细胞死亡。抗菌肽抗菌作用无特异性，具有很宽的抗菌谱，对革兰氏阳性、革兰氏阴性、真菌都有作用，且其代谢物是氨基酸，对宿主细胞的毒性小，是一类应用前景广阔的新型抗菌药。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。本专利技术的另一个目的在于提供一种由上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。本专利技术的再一个目的在于提供一种人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它是将上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：3所示。本专利技术的第四个目的在于提供上述人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：4所示。本专利技术的第五个目的在于提供上述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的人工合成方法。本专利技术的第六个目的在于提供所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述多重耐药性病原菌为MRSA和VRE。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。按上述方案，所述非洲帝王蝎抗菌肽基因是首次从非洲帝王蝎（Pandinusimperator）毒腺中分离得到的，具体通过如下步骤获得：（1）首先提取非洲帝王蝎毒腺mRNA，通过反转录和PCR扩增得到大小不一的双链cDNA，再将双链cDNA与载体连接并转化后，构建得到cDNA文库；（2）采用PCR策略从上述cDNA文库中筛选PCR产物为300-600bp大小的克隆子，进行测序并进行NCBI数据库搜索，经过blast发现了一个cDNA序列和已有报道的AmAP2、Antimicrobialpeptide143、AP1、NDBP13和Putativeantimicrobialpeptideclone5等抗菌肽编码基因的同源性分别为43%、43%、39%、40%和43%，这表明，该筛选得到的cDNA编码一个新抗菌肽基因。一种由上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；所述非洲帝王蝎抗菌肽由80个氨基酸残基组成，包括三部分：22个氨基酸残基长的信号肽，18个氨基酸残基长的成熟肽，以及40个氨基酸残基长的前体肽（见图1）。人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它是将上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：3所示。按上述方案，对所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4通过Jpredserver、NPSAserver和HeliQuest软件结构预测，发现该非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4具有典型线性抗菌肽的结构特征：α-螺旋并有疏水和亲水面（结构特征示意图见图2）。人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其特征在于，它是基于非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的氨基酸序列进行点突变后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：4所示。按上述方案，所述的点突变需遵循以下原则：1、在保持现有非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的α-螺旋结构的前提下，尽量使突变后的抗菌肽两亲性更加明显，即使得其疏水面更疏水、亲水面亲水性更强；2、增强亲水面的静电荷数量，提高其对磷脂膜的静电吸引作用；3、去掉对形成α-螺旋结构有破坏作用的氨基酸。将突变后得到的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。3.人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：3所示。4.权利要求3所述的人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQIDNO：4所示。5.非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪春，张磊，聂尧，
申请(专利权)人：中国地质大学武汉，
类型：发明
国别省市：湖北;42