本发明专利技术提供了检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法，属于基因工程领域。本发明专利技术通过基因克隆的方法获得了鸭MAPK1的全基因序列，并建立了一种快速检测鸭体内MAPK1基因表达水平的荧光定量RT-PCR方法。本发明专利技术提供的鸭MAPK1基因序列如SEQ ID NO.1所示，用于特异性检测该基因的荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO.3和4所示。本发明专利技术方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有优异的检测能力，可用于研究鸭MAPK1在致病过程中的作用，具有良好的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法，属于基因工程领域。本专利技术通过基因克隆的方法获得了鸭MAPK1的全基因序列，并建立了一种快速检测鸭体内MAPK1基因表达水平的荧光定量RT-PCR方法。本专利技术提供的鸭MAPK1基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，用于特异性检测该基因的荧光定量PCR引物序列如SEQ?ID?NO.3和4所示。本专利技术方法具有检测准确、灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有优异的检测能力，可用于研究鸭MAPK1在致病过程中的作用，具有良好的应用价值。【专利说明】检测鸭MAPK1基因的荧光定量RT-PCR方法
本专利技术属于基因工程领域，具体地，涉及鸭MAPKl基因及荧光定量检测该基因的方法。
技术介绍
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种细胞过程。在哺乳动物细胞中已发现和克隆了 ERK、JNK/SAPK、p38/RK和ERK5/BMK1四个MAPK亚族。这些MAPK能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要调控作用。不同MAPK亚族被其上游激酶激活后，可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和酶类等多种底物来调节多种细胞生理过程，包括炎症、应激、细胞生长、发育、分化、死亡和功能同步化等。MAPK亚族成员对下游蛋白激酶的磷酸化是发挥其生理作用的重要方式。丝裂原活化蛋白激酶I(MAPKl)又称为细胞外信号调节激酶2 (extracellular signal-regulatedkinase2, ERK2)，其分子量为 42KDa。与人和哺乳动物相比，禽类MAPKl的研究相对滞后，目前只有关于鸡MAPKl的部分研究报道。鸭MAPKl基因未见报道，为研究鸭MAPKl在鸭发病过程中的作用以及其在鸭体内的表达水平，急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。荧光定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、自动化程度高等特点，现已被广泛地应用于分子生物学及医学等研究领域，发挥着重大作用。目前将荧光定量RT-PCR用于检测鸭MAPKl基因的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鸭MAPKl基因的全基因序列。本专利技术的另一目的在于提供一种快速检测鸭体内MAPKl表达水平的荧光定量RT-PCR 方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案:(I)根据GenBank上发表的鸡MAPKl基因序列(登录号:NM_204150)，用PrimerPremier5.0软件设计上游引物MAPKl-AF和下游引物MAPK1-AR(核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示)。提取鸭脾脏总RNA，用Random Primer (由单链六聚体组成，六个碱基的随机组合，购自Promega公司)为反转录的引物，以RNA为模板合成cDNA。以cDNA为模板，MAPK1-AF/MAPK1-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析、回收。将回收的PCR产物通过连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为PMD18-MAPK1。(2)使用 3’ full RACE Kit 和 5’ full RACE Kit，根据 RACE 操作的要求，在测序正确的区域设计3’端和5’端特异性引物。提取鸭脾脏总RNA，按照3’ full RACE Kit试剂盒说明书进行 3’ full RACE 实验。用 MAPK1-3GSP1 (SEQ ID N0.7)和 3’ RACE OuterPrimer (SEQ ID N0.9)进行 Outer PCR 反应，MAPK1-3GSP2 (SEQ ID N0.8)和 3’RACE InnerPrimer (SEQ ID N0.10)进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’ -pMD18-MAPKl。(3)提取鸭脾脏总RNA，按照5’ full RACE Kit试剂盒说明书进行5’ full RACE实验。用 MAPK1-5GSP1 (SEQ ID N0.11)和 5’RACE Outer Primer (SEQ ID N0.13)进行Outer PCR 反应，MAPK1-5GSP2 (SEQ ID N0.12)和 5，RACE Inner Primer (SEQ ID N0.14)进行Inner PCR反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物、回收。将回收的PCR产物与PMD18-T连接，将连接产物转入DH5 α感受态中，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为5’ -pMD18-MAPKl。(4)将 pMD18-MAPKl、3’ -PMD18-MAPK1 和 5’ -pMD18-MAPKI 质粒的测序结果进行拼接，得到鸭MAPKl的全基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。因此，本专利技术提供了克隆鸭MAPKl基因的方法，包括以下步骤:(I)提取鸭脾脏总RNA，反转录为cDNA ；以cDNA为模板，MAPK1-AF和MAPKl-AR为引物，PCR扩增MAPKl基因；扩增产物回收后与PMD18-T载体连接、转化、提取阳性克隆测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为PMD18-MAPK1 ;上游引物MAPKl-AF和下游引物MAPKl-AR的核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示；(2)提取鸭脾脏总 RNA，用 MAPK1-3GSP1 和 3’ RACE Outer Primer 进行 Outer PCR反应，MAPK1-3GSP2和3’ RACE Inner Primer进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与PMD18-T载体连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为3’ -pMD18-MAPKl ；MAPK1-3GSP1和MAPK1-3GSP2，核苷酸序列如SEQID N0.7 和 8 所不，3’ RACE Outer Primer 和 3’ RACE Inner Primer 核苷酸序列如 SEQ IDN0.9和10所示；(3)提取鸭脾脏总 RNA，用 MAPK1-5GSP1 (SEQ ID N0.11)和 5 ’ RACE Outer Primer(SEQ ID N0.13)进行 Outer PCR 反`应，MAPK1-5GSP2 (SEQ ID N0.12)和 5’ RACE InnerPrimer (SEQ ID N0.14)进行Inner PCR反应，将回收的PCR产物与pMD18_T连接，转化，选取疑似阳性克隆进行测序，测序结果与鸡MAPKl序列进行比较，测序正确的质粒命名为5，-pMD18-MAPKl ；MAPK1-5GSP1 和 MAPK1-5GSP2本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭MAPK1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于圣青，曹守林，韩先干，王少辉，丁铲，田明星，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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