本发明专利技术涉及一种独立核苷酸序列，它是编码婴儿利什曼虫PFR1蛋白或其片段的序列，其中的PFR1蛋白或其片段含有至少一种从以下组别中选取的免疫显性表位：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8，其中的免疫显性表位可以诱导动物抗原特异性T细胞毒性免疫反应，该反应的对象为导致利什曼病的动质体。上述免疫显性表位激活的T细胞毒性淋巴细胞，并对I类A2型MHC分子具有高度结合亲和力。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由具有特定免疫显性表位的婴儿利什曼虫PFR1蛋白片段组成的嵌合分子可用于抗利什曼病的免疫疗法
本专利技术属于化学和药品行业，医学、分子生物学、免疫学、寄生虫学和兽医学领域，涉及用于控制利什曼病的免疫学工具。所述疾病是由利什曼虫属中不同种类的原虫所引起。
技术介绍
利什曼虫属的物种(原生动物细胞内寄生虫)属于动质体目锥虫科，分布于全球的热带和亚热带地区，会引起名叫利什曼病的广泛临床症状。根据引发疾病的物种不同，利什曼病可以分为皮肤型、皮肤粘膜型和内脏型(根据其组织嗜性和临床引起的症状)。利什曼病近年的发病率大幅上升，成为遍及全大陆88个国家的地方病，据称有3.5亿人面临感染该疾病的风险。(WHO报告，http://who.int/ctd/html/leisdis.html)。据估计，全球约有1200万人受利什曼病的影响。在每年200万的新发病例中，500,000例为内脏型利什曼虫病(VL)。该疾病是由婴儿利什曼虫和杜氏利什曼虫引起的，症状包括间歇热、贫血、脾肿大、肝肿大和淋巴结病。VL会使受影响病人的免疫力下降，引起合并感染，所以常导致死亡。近年，利什曼虫/HIV合并感染成为地中海地区国家的主要健康问题。在这些国家中，犬类是主要宿主，是人类该疾病的储主(Alvar等人.2004国际寄生虫学期刊57:1-88)。接种疫苗是预防传染病因子引起疾病和死亡的最有效治疗方法。尽管如此，目前对抗病原体的高效疫苗非常少，其中一种疫苗能有效对抗传染病因子。近年，在不同的利什曼原虫中对多种抗原疫苗及其制品进行试验，并得出了迥然不同的结果(Kedzierski等人.2010.世界传染病杂志2(2):177-85；Kedzierski等人.2006.寄生虫学,133:87-112；Requena等人.2004.生物疗法专家评论4(9):1505-17)。但到目前为止，还没找到令人完全满意的疫苗。对抗疾病的另一个选择是治疗药物，或在没有治疗药物时，采用化学免疫疗法。试验在含佐剂的巴氏消毒完整寄生虫(Convit等人.2003医学和卫生学97:469-72)以及寄生虫和抗原的混合物中进行(Badaro等人.2006感染性疾病杂志194:1151-9)，但和疫苗的情况相类似，试验没有取得最终的成功(El-OnJ.2009.以色列医学学会期刊11(10):623-8)。如上文所述，犬类是该疾病的主要储主，所以也从对抗这种人畜共患病的免疫学角度出发，做出了一些尝试。事实上，利什曼病对犬类来说是严重的寄生虫病。最常见的临床症状是脱毛，特别是眼睛、耳朵和鼻子周围的毛。当疾病进一步恶化时，狗没有食欲且体重下降，且皮肤通常会出现伤口，特别是头部和腿部，并出现肾衰竭的相关症状。该疾病是西班牙大部分地区以及地中海地区绝大部分国家的地方病。和在人类中的情况相似，人们为控制该疾病做出了多方面的尝试，但迄今为止还未得到完全令人满意的成功(Alvar等人.2004.国际寄生虫学期刊57:1-88；Reis等人.2010寄生虫学趋势26(7):341-9).无论是人类还是犬利什曼病，最具有潜力的控制方法之一都指向使用DNA疫苗。该疫苗携带多个编码特定利什曼虫抗原或含不同寄生虫抗原的嵌合重组蛋白的基因(DeOliveira等人.2009国际寄生物学58(4):319-24；Palatnik-de-Sousa,2008.疫苗26:1709-1724).PFR蛋白(副鞭毛杆蛋白)代表了一个tripanosomatids相关特定抗原的家族，位于这些寄生虫的副鞭毛区(Fouts等人.，1998生物化学杂志273(34):21846-21855；Clark等人.，2005.寄生虫学研究杂志96(5):312-320)。该抗体家族某些成员(PFR1-3蛋白)的高免疫原性尤为突出(Michailowsky等人.，传染与免疫71(6):3165-3171)。从克氏锥虫中纯化出带PFR1和PFR2的小鼠免疫，其所诱导的Th1免疫反应在实验性感染试验中，可以减少已接种疫苗并已感染克氏锥虫寄生虫小鼠的心脏组织中克氏锥虫的载量(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055)。这些结果显示，PFR蛋白可能适合作疫苗使用。根据这些结果，发现从接种PFR小鼠中分离到的淋巴细胞CD4+可以激活寄生虫感染的巨噬细胞，通过释放NO使寄生虫死亡(Wrightsman等人.2000疫苗18(14):1419-27,Miller等人.1997免疫学杂志158(11):5330-7)，还可以在缺少B细胞，但不缺少功能性CD4+和CD8+淋巴细胞的情况下，减少血液中的寄生虫水平。从基因免疫的角度出发，对不同动质体的不同副鞭毛蛋白进行了研究。L.mexicanaPFR2蛋白在作为DNA和重组蛋白接种后，显示出免疫原性和保护能力(Saravia等人.2005疫苗23:984-995)。小鼠在接种含仅编码克氏锥虫PFR2蛋白基因或嵌合相同病原体的Hsp70蛋白基因的DNA载体后，诱导出高水平的IgG2a型抗PFR抗体。但是，只有接种嵌合疫苗的小鼠激发产生出IL-12和IFN-γ，并使产生IL-4的细胞减少，引发抗克氏锥虫的保护反应(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055).Hsp70蛋白属于热休克蛋白(HSP)家族，在多个不同物种中都具有广泛的保守性(真核生物和原核生物)。他们通过发挥伴护作用，成为维持细胞自动调节的基础(Smith,Whitesell等人.1998药理学评论50(4):493-513)。它们有趣的地方在于可以激活免疫系统，突出Hsp70的免疫多功能性。Hsp70蛋白是从肿瘤细胞或病毒感染细胞中获取，它在体内和体外都可以激活CD8+CTL反应，对抗纯化出免疫原蛋白细胞中的多种表达抗原(Srivastava.2002自然免疫学评论2:185-194；Wu等人.,2005.癌症研究65(11):4947-4954)。因此，细胞外的Hsp70可以和抗原肽形成复合物，同时激活APCs。这种相互作用激发一连串事件，包括肽交叉呈递到CD8+(限制MHCI)和TCD4+细胞(限制MHCII)、分泌促炎细胞因子、以及树突细胞(DCs)表型及功能的成熟(Asea等人.2000自然医学6:435-442；Basu等人.2001免疫学14:303-313；Harmala等人.2002免疫学杂志169:5622-5629；Tobian等人.2004免疫学杂志173:5130-5137)。我们在实验室进行了体外试验，显示克氏锥虫Hsp70蛋白对首次接受试验小鼠的脾和神经节细胞产生特有的刺激效应(等人.,2000.国际免疫学12(12):1685-1693)，导致T细胞产生快速而强烈的刺激。此外，这种蛋白可以在体外和体内产生抗相关半抗原的混合免疫反应(IgG1和IgG2a)。有趣的是，这种反应独立于TLR2和TLR4受体(Qazi等人.2007疫苗25(6):1096-1103)。小鼠接种了携带编码克氏锥虫HSP70蛋白和KMP11蛋白序列的载体后，这种克氏锥虫HSP70蛋白可以引发抗KMP11蛋白的特异反应。该反应是通过激活IgG2a型特异抗体的产生，以对抗KMP11(Thoma本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于编码婴儿利什曼虫及其片段PFR1蛋白的核苷酸序列，含有以下任一组中至少一个免疫显性表位：SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7和SEQ ID No：8，该免疫显性表位可以诱导动物T细胞的抗原特异性细胞毒性免疫反应，对抗引起利什曼病的动质体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.21 ES P2011312571.一种嵌合分子，包括用于编码婴儿利什曼虫PFR1蛋白的核苷酸序列，其中，编码婴儿利什曼虫PFR1蛋白的核苷酸序列由SEQIDNo：12决定，所述核苷酸序列融合到编码克氏锥虫Hsp70蛋白的核苷酸序...
【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽亚·戴尔·卡门·托马斯·卡佐拉，曼纽尔·卡洛斯·洛佩兹·洛佩兹，达里安·莱德斯马·阿罗约，
申请(专利权)人：西班牙国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES
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