本发明专利技术公开了一种同步分离测定草坪草内源脱落酸、赤霉素和生长素的方法，涉及植物内源激素分析技术领域。本发明专利技术包括以下步骤：①内源脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的快速提取；②固相萃取洗脱：③高效液相色谱-质谱分析。本发明专利技术前处理简单，耗时短；化学试剂用量少，有效节约成本；检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生；其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法实现了在草坪草样品的粗提取液中直接同步进行脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的测定，回收率高，达94.6～96.5%。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，涉及植物内源激素分析
。本专利技术包括以下步骤：①内源脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的快速提取；②固相萃取洗脱：③高效液相色谱-质谱分析。本专利技术前处理简单，耗时短；化学试剂用量少，有效节约成本；检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生；其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法实现了在草坪草样品的粗提取液中直接同步进行脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的测定，回收率高，达94.6～96.5%。【专利说明】
本专利技术涉及植物内源激素的测定领域，具体涉及一种。
技术介绍
随着我国经济的发展和生态环境意识的加强，以及城市化进程的加快和城市绿化标准的提升，草坪业的发展迎来了良好的机遇，草坪草的需求不断增大。草坪作为城市生态系统中的一个重要组成部分，在防治污染及改善生态环境中能起到净化空气、杀菌、减噪、防止水土流失和改善小气候等作用，并具有很强的观赏性和娱乐性。在雾霾频发的今天，如何改善我们的居住生活环境任重而道远，草坪草在环境改善方面的作用举足轻重。植物内源激素虽然在草坪草内含量极低，但对草坪草生长发育的基本规律和代谢过程具有重要的调控作用，已成为植物生理学领域的重要内容之一。由于植物内源激素含量低，性质不稳定，分离时易被破坏，加之细胞中其他化合物的干扰，故对植物内源激素的准确测定，对植物生命活动和作物遗传育种栽培领域的研究具有重要意义。如何精确、实时和可靠地对超微量的植物内源激素进行定性定量分析，是目前植物激素作用机理研究中的瓶颈之一。近年来，色谱技术的飞速发展使其在植物内源激素检测中的应用越来越广泛。高效液相色谱(HPLC)作为一种较理想的植物内源激素分析方法，因其灵敏度高、选择性好、重复性好和分析快速等优点，已在除乙烯外的四大类植物激素和生长调节剂的研究领域中被广泛应用。利用HPLC对植物内源激素定量测定的关键在于选择出适合的内源激素提取方法和色谱条件。但生物体内源激素极为复杂和特殊，目的成分的分离提取显得至关重要，直接影响其精密度和回收率。传统的高效液相色谱法测定植物内源激素时，通常是利用80%的冰甲醇来提取内源激素，过滤收集滤液，利用旋转蒸发仪蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，溶化后，离心取上清液，调节PH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样测定。现有的技术不但操作复杂，耗时长，而且检测种类少，无法完成同时对4大类内源激素的检测，回收率相当低(约为80%)，其提取方法和色谱条件不适用于草坪草，不利于准确地测定草坪草内源激素含量。这些问题说明这种方法已经难以满足植物内源激素检测中大量样品的快速检测需要，因此人们迫切需要一种简单、快速及价廉的检测技术。近年来，液相色谱-质谱(HPLC-MS)技术得到了迅速的发展，其将高效液相色谱法对复杂样品的优异分离能力，与质谱法具有的高选择性、高灵敏度、能提供相对分子量和结构信息的优点结合起来。国外已有学者将这一 HPLC-MS技术应用于植物激素的检测，虽刚刚起步，但具有如下优点:①检测限低、灵敏度高、选择性好，不需要衍生，化学试剂用量少；②实现了在植物样品的粗提取液中直接进行生理水平植物激素的检测。可预见其在植物激素的检测中将发挥重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的主要是针对植物内源激素检测的操作复杂、耗时长和回收率低，无法满足草坪草内源激素检测中快速检测需要等问题，提供一种。本专利技术的特色是前处理简单，不需要衍生，节约成本，耗时短，尤其适用于草坪草内源激素的测定，可快速、准确测定草坪草内源激素。本专利技术的目的是这样实现的: ，主要包括以下步骤: ①内源脱落酸、赤霉素和生长素的快速提取: 首先加提取液浸提，然后离心，过滤，脱色，最后进行真空浓缩，完成内源脱落酸、赤霉素和生长素的快速提取； ②固相萃取洗脱: 溶解获得的内源脱落酸、赤霉素和生长素，过96孔的固相萃取小柱(Oasis MCXcolumn)逐步洗脱，然后将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物； ③高效液相色谱-质谱分析: 将固相萃取洗脱物用流动相溶解后，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)进样分析。本专利技术具有下列优点和积极效果: ①前处理简单，耗时短； ②化学试剂用量少，有效节约成本； ③检测灵敏度高、选择性好，不需要衍生； ④其分离提取方法、色谱分离条件和质谱检测方法实现了在草坪草样品的粗提取液中直接同步进行脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的测定，回收率高，达94.6?96.5%。【专利附图】【附图说明】图1是脱落酸(ΑΒΑ)、赤霉素(GA3)、生长素(IAA、IBA)混合标样质谱图； 图2是狗牙根叶片脱落酸(48么)、赤霉素(6么3)、生长素(IAA、IBA)质谱图。【具体实施方式】下面结合实施例详细说明: 1、试验材料:经盐胁迫(处理浓度为150 mmol/L NaCl)处理30 d(天)的狗牙根材料(选用中国科学院武汉植物园草坪种质资源圃编号为C136狗牙根)。2、检测步骤 O内源激素的提取 A、浸提:取0.5g鲜样，用液氮研磨，然后加提取液5 ml, -20°C提取过夜，得浸提液； 所述的提取液即甲醇:甲酸冰=15:1:4，按v/v,再加40 mg/ml 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚作为抗氧化剂； B、离心:将浸提液在15000转/min，4°C下离心lOmin，收集上清液置于新管并保存于-20°C，残渣再用5ml提取液于-20°C提取lh，离心，收集上清液并混合于前一次的上清液，得离心液；C、过滤:将收集的离心液过20Mm滤膜以去除残渣和较小的颗粒物，收集滤液，得过滤液； D、脱色:先用Iml100%甲醇和Iml lmol/L甲酸平衡C18固相萃取柱，然后将过滤液过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取小柱，并连接上真空泵，以lml/min的速度抽滤，以去除色素和脂类物质；过小柱后，收集滤液，再用Iml的样品提取液洗脱小柱中的样品并收集滤液，得脱色滤液； F、真空浓缩: 将收集的脱色滤液置于真空浓缩仪中，于40°C浓缩至完全干燥，即完成内源脱落酸(ΑΒΑ)、赤霉素(GA3)和生长素(IAA，IBA)的提取。2)固相萃取洗脱: Α、用2ml lmol/L甲酸溶解沉淀,得甲酸溶解液； B、分别用Iml100%甲醇和Iml lmol/L甲酸平衡96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取小柱，然后将甲酸溶解液过小柱以吸附激素，弃滤液； C、用Iml的lmol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，收集滤液，该收集液中含有脱落酸、生长素和赤霉素三大类激素； C、用Iml的lmol/L甲酸洗柱后，用2ml甲醇洗柱，收集滤液，该收集液中含有脱落酸(ΑΒΑ)、生长素(IAA，IBA)和赤霉素(GA3)三大类激素； D、将洗脱液置于真空浓缩仪中40°C浓缩至完全干燥； E、过程B和C需将96孔的混合型阳离子交换反相固相萃取柱置于真空抽滤装置上并连接真空泵，以lml/min的速率进行抽滤，以提高洗脱效率。3 )高效液相色谱-质谱(HPLC-MS )连用分析: A、将真空浓缩获得的沉淀用200~500μ1流动相溶解，得流动相溶解液； B、用一次性医用注射器吸取流动相溶解液过本文档来自技高网...
【技术保护点】
同步分离测定草坪草内源脱落酸、赤霉素和生长素的方法，其特征包括以下步骤：①内源脱落酸、赤霉素和生长素三大类激素的快速提取：首先加提取液浸提，然后离心、过滤、脱色，最后进行真空浓缩，完成內源脱落酸、赤霉素和生长素的快速提取；②固相萃取洗脱：溶解获得的内源脱落酸、赤霉素和生长素，过96孔的固相萃取小柱逐步洗脱，然后将洗脱液真空浓缩，得固相萃取洗脱物；③高效液相色谱?质谱分析：将固相萃取洗脱物用流动相溶解后，将流动相溶解液过滤后上高效液相色谱?质谱进样分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：傅金民，胡龙兴，娄燕宏，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：
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