本发明专利技术公开了一种从火木层孔菌菌火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinus linteus(Berk et Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(Allesch et Schnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的3',4'-二羟基苯乙酮。本发明专利技术首次公开了3',4'-二羟基苯乙酮的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了3',4'-二羟基苯乙酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。
【技术实现步骤摘要】
,4’-二羟基苯乙酮在抗禽流感h5n1病毒上的应用的制作方法【专利摘要】本专利技术公开了一种从火木层孔菌菌火木层孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinus?linteus(Berk?et?Curt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus?hartigii(Allesch?et?Schnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的3',4'-二羟基苯乙酮。本专利技术首次公开了3',4'-二羟基苯乙酮的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了3',4'-二羟基苯乙酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。【专利说明】，4’-二羟基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用
本专利技术涉及一种抗禽流感病毒H5N1的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及到的火木层孔菌菌株，已于2013年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.8108，生物样品分类名称为火木层孔菌Phellinus igniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
技术介绍
火木层孔菌，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱，边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质，菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝，管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个，孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米，刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米，菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。苯乙酮是一种无色晶体，或浅黄色油状液体，有山楂的气味。熔点20.5°C，沸点202.3°C，密度(20/4°C) 1.0281g/cm3。微溶于水，易溶于多种有机溶剂。能与蒸气一起挥发，氧化时可以生成苯甲酸；还原时可生成乙苯，完全加氢时生成乙基环己烷。用于制香皂和香烟，也用作纤维素酯和树脂等的溶剂和塑料工业生产中的增塑剂等。可由苯与乙酸酐反应制得，或由乙苯氧化制得，也可用乙酰氯与苯在三氯化铝作用下经傅氏反应制得。3’，4’ - 二羟 基苯乙酮的抗菌活性已经被证实，如今，未见到有抗情流感病毒活性的报到。
技术实现思路
本专利技术公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的3’，4’-二羟基苯乙酮。本专利技术首次公开了 3’，4’_ 二羟基苯乙酮的一种新活性，测定了其对MDCK细胞的最大无毒浓度，证明其具有抗禽流感H5N1病毒的作用。本专利技术的技术方案如下: 首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05% (2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20~35°C温度，摇瓶转速为80~280r/min，pH 3~8条件下，震动培养7~15天；培养中当pH值降到2.5~4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20~35°C，发酵罐压力0.1~0.2公斤/平方厘米，pH 3~8，通气量0.5~1.lvvm,搅拌速度100~280转/分的条件，培养7~15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2~1/5 ； (4)用体积百分比为60~95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2~8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60~90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍； (5)对步骤(4)所得提取液在50~70°C条件下，加热I~2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5~1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。然后从火木层孔菌粗提物中制备3’，4’ - 二羟基苯乙酮，步骤如下:火木层孔菌粗提物一乙醇沉淀一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一甲醇凝胶层析一TLC检测一反相硅胶层析一TLC检测一减压蒸干一无色油状物(3’，4’ - 二羟基苯乙酮)。具体方法为: (1)制备火木层孔菌菌粗提物； (2)将上述步骤(1)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，置于通风设备处干燥并搅拌； (3)对上述步骤(2)后制备的原料进行硅胶正相`柱层析，使用洗脱剂洗脱2至5次，得到洗脱液； (4)将步骤(3)中的最后一次洗脱液等体积硅胶拌样，进行硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (5)收集步骤(4)的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (6)对步骤(5)得到的产物进行常压反相柱层析，使用洗脱剂洗脱； (7)收集步骤(6)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，得到3’，4’-二羟基苯乙酮。优选的，提取步骤⑵中所述的硅胶为100-200目正相硅胶； 提取步骤(3)中所述的硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇； 提取步骤(4)中所述的硅胶用量为1-3倍体积，洗脱剂为氯仿； 提取步骤(5)中所述的凝胶为S^hadex LH-20，洗脱剂为甲醇或丙酮； 提取步骤(6)所述的反相硅胶为反相C-8、C-18，洗脱剂为甲醇； 提取步骤⑵中TLC检测要点是出现红色斑点，展开剂为氯仿:甲醇=30:1-40:1。然后使用得到的3’，4’ - 二羟基苯乙酮进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC5tl)及最大安全浓度； 最后在最大安全浓度范围内进行样品在MDCK细胞水平上对H5N1毒株的作用，计算样品的半数毒性浓度(CC5tl)和半数有效浓度(EC5tl),得到样品的选择指数(SI)=CC5tl / EC50,计算抑制率。本专利技术的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的一种苯乙酮。技术路线成熟明确、高效精确，并首次证明了其具有抗禽流感H5N1病毒的活性。(四)【具体实施方式】 实例1: 火木层孔菌粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1%葡萄糖 1% 蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1% 硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01% (2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当PH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
3',4'‑二羟基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晨，宋爱荣，孔超，黄芳，梁大勇，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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