锌金属硫蛋白的生产工艺制造技术

一种锌金属硫蛋白的生产工艺，它包括以下几个步骤：（１）诱导：将哺乳动物注射ＺｎＣｌ↓［２］，其最大量达８０ｍｇ／ｋｇ体重，（２）粗提：经生理盐水洗净的肝脏加入混合液，并经匀浆、超声波粉碎，分离去沉淀，以无水乙醇沉淀后得到乙醇粗提物，（３）柱层析分离、洗脱收集总金属硫蛋白，（４）浓缩脱盐：以超过滤浓缩脱盐或真空冷冻干燥浓缩后柱层脱盐，（５）分装、冻干得成品。也可以是将含盐的总金属硫蛋白（ＭＴ）经真空冷冻浓缩或超过滤浓缩后上层析柱，分离出ＭＴ－１、ＭＴ－２再分别浓缩脱盐，分装冻干，本工艺生产操作方便，效率高，整个产品的得率比其他方法高出２０－４０％。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于金属硫蛋白的生产工艺。金属硫蛋白是1957年发现的，含有镉及锌的蛋白质是从马的肾脏中分离出来的，以后实质相同的蛋白质从兔、牛、羊等动物中分离，马的金属硫蛋白的分子量为6000-7000，金属含量高，它含有61个氨基酸残基，不含芳香族氨基酸，在61个氨基酸残基中有20个半胱氨酸，在第一届金属硫蛋白国际会议上，确定了具有上述特性并和马肾的金属硫蛋白相似的蛋白质为金属硫蛋白(MT)，由于MT具有的结构特征，决定了它具有极其重要的生理功能，MT在人体中参与微量元素的储存、运输和代射，参与激素和发育过程的调节，增强机体对应激的适应，能够清除自由基及抗电离辐射等，随着人们对MT的深入研究，其用途日益广泛，那么对于MT的需求，不再是试验室的方法，一次提取几十微克，这远远不能满足社会对MT的需求，因此有必要提供一种批量制取金属硫蛋白的生产工艺。本专利技术目的是提供一种批量地生产锌金属硫蛋白(ZnMT)的工艺，利用本工艺，可使ZnMT的得率高，生产容易操作，效率高。为达到上述目的，本专利技术采用以下几个步骤(1)诱导将哺乳动物(兔、羊)注射ZnCL2，注射量逐渐上升，注射量在10-80mg/kg体重，诱导期大约8天;(2)粗提将经诱导的动物屠宰取肝，用生理盐水清洗，称重，加入予冷的含乙醇的混合液，匀浆、超声波粉碎，离心分离去沉淀，上清液内滴加予冷的无水乙醇，乙醇最终浓度约75%(体积比)，静置并离心分离，得沉淀，将沉淀以缓冲液溶解，分离去沉渣，得到棕黄色上清液为乙醇粗提物;(3)柱层析分离上述金属硫蛋白(MT)，上样量为柱床体积的20-30%，经洗脱分离，收集第二个无色峰即为含盐的总金属硫蛋白(MT);(4)浓缩脱盐将(3)得到的总MT于超过滤下浓缩脱盐;(5)分装、冻干得产品。浓缩脱盐步骤中，除了采用超过滤进行浓缩脱盐外，还可以通过真空冷冻浓缩，经层析脱盐。除了上述获得总MT外，还可以将步骤(3)得到的总MT经真空冷冻浓缩或超滤浓缩后，再按柱床体积的10-20%上层析柱，经缓冲液直线梯度洗脱，收集MT-1，MT-2，然后分别浓缩脱盐、分装、冻干，获得分型的MT产品。本专利技术的优点是本工艺中，采用ZnCl2作为诱导剂，由于ZnCl2无毒性，所用剂量大于CdCl2、ZnSO4等，使得哺乳动物的肝脏产生更多的MT;在破碎上采用组织捣碎和超声波破碎相结合，有利于MT的提取，可提高MT的得率;为实现批量生产，采用先浓缩后层析分离工艺;利用超过滤浓缩除盐，减少液态停留时间，降低MT二聚体的聚合率;在成品上采用分装冻干，以达到批量生产的目的。实施例1(1)诱导取家兔一只，重3kg，于第一、二、四、七天分四次皮下注射ZnCl2悬浮液，每次注射量第一次60mg，第二、三次分别为105mg，第四次150mg，每次体积不大于2ml，于第九天屠宰动物，取肝脏。(2)粗提肝脏用生理盐水洗涤后，称重约100g，加入予冷的混合液55ml，混合液组成是0.01MTris-Hcl，PH8.6无水乙醇氯仿＝1∶00∶1.03∶0.08(体积比)，匀浆5分钟后，在超声波下处理5分钟，4℃，15000g离心30分钟，除去沉淀。上清液在磁力搅拌下滴加-20℃予冷的无水乙醇，使乙醇最终浓度达75%(体积比)，置20℃冰柜内过夜(12-20小时)，静置下吸去上清液约70%，余下液体离心分离，沉淀用20ml0.01MTris-HclPH8.6缓冲液溶解，再用4℃12000g离心分离去沉渣，棕黄色上清液即为乙醇粗提物(约35ml)。(3)柱层析分离上述金属硫蛋白(MT)，由(2)得到的乙醇粗提物直接上用0.01MPH8.6的Tris-Hcl缓冲液平衡好的SephadexG-50柱(4.5×130cm)，上样量为柱床体积的20-30%，并用同一缓冲液进行洗脱分离，在波长254nm的监测下收集第二个无色的峰，此峰即为含盐的总金属硫蛋白(MT)约200ml。(4)浓缩脱盐，将(3)得到的总MT于超滤下浓缩脱盐，使体积达到100ml的浓缩液。(5)浓缩液经分装、冻干得到成品重为140mg。实施例2(1)诱导取家兔一只，重4kg，于第一、二、四、七次皮下注射ZnCl2悬浮液，其注射量是第一次100mg，第二、三次160mg，第四次240mg，注射体积不大于2ml。(2)粗提其操作条件与实施例1相同。(3)柱层析分离上述金属硫蛋白(MT)，其操作条件与实施例1相同。(4)浓缩脱盐采用真空冷冻干燥后，加20ml(NH4)2CO3溶解成溶液或真空冷冻浓缩成约20ml溶液，再用0.01M(NH4)2CO3溶液平衡好的SephadexG-50(35×120cm)并以此溶液进行层析脱盐。(5)分装、冻干制得成品重为150mg。实施例3(1)、(2)、(3)的操作条件与实施例2相同。由(3)得到的总金属硫蛋白(MT)以超滤浓缩30分钟后，上用0.01M、PH8.6的Tris-Hcl缓冲液平衡好的DEAESepharoseA50柱(或DEAESepharoseFastFlow柱)进行直线洗脱(洗脱液浓度可在0.01M-0.35M之间)，在波长为254nm的监测仪监测下逐一收集MT-1，MT-2峰，然后以实施例1、2方法浓缩脱盐、分别分装、冻干即为成品。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锌金属硫蛋白的生产工艺，其特征在于它包括以下几个步骤：（１）诱导：将哺乳动物（兔、羊）注射ＺｎＣｌ↓［２］，诱导期约８天，注射量控制在１０ｍｇ／ｋｇ体重－８０ｍｇ／ｋｇ体重之间，并逐次增大；（２）粗提：将经诱导的动物屠宰取肝，用生理盐水清洗、称重，加入予冷的含乙醇的混合液，匀浆、超声波粉碎处理，离心分离去沉淀，上清液内滴加予冷的无水乙醇，控制乙醇的最终浓度约达７５％（体积比），静置并离心分离，得沉淀，将沉淀以缓冲液溶解，分离去沉渣，得棕黄色上清液为乙醇粗提物；（３）柱层析分离上述金属硫蛋白（ＭＴ），上样量为柱床体积的２０－３０％，经洗脱分离，收集第二个无色峰即为含盐的总金属硫蛋白（ＭＴ）；（４）浓缩脱盐：将（３）得到的总ＭＴ于超过滤下浓缩脱盐；（５）分装、冻干得产品。

【技术特征摘要】
1.一种锌金属硫蛋白的生产工艺，其特征在于它包括以下几个步骤(1)诱导将哺乳动物(兔、羊)注射ZnCl2，诱导期约8天，注射量控制在10mg/kg体重-80mg/kg体重之间，并逐次增大；(2)粗提将经诱导的动物屠宰取肝，用生理盐水清洗、称重，加入予冷的含乙醇的混合液，匀浆、超声波粉碎处理，离心分离去沉淀，上清液内滴加予冷的无水乙醇，控制乙醇的最终浓度约达75%(体积比)，静置并离心分离，得沉淀，将沉淀以缓冲液溶解，分离去沉渣，得棕黄色上清液为乙醇粗提物；(3)柱层析分离上述金属硫蛋白(MT)，上样量为柱床体积的20-30%，经洗脱分离，收集第二个无色峰即为含盐的总金属硫蛋白(MT)；(4)浓缩脱盐将(3)得到的总MT于超过滤下浓缩脱盐；(5)分装、冻干得产品。2.按权利要求1所述的锌金属硫蛋白的生产工艺，其特征在于所述的予冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金琪，陆静玫，薛小平，王祖荣，任道生，李旭，唐心利，
申请(专利权)人：北京市科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]