利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片技术

本发明专利技术公开了利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片。本发明专利技术提供了一种制备用于检测CP4-EPSPS的QCM金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；2）将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术利用石英晶体微天平生物传感器对MCMV的检测进行了研究，通过对两种修饰金片方法11-MUA单独修饰QCM金片和3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片作比较，分析3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片检测灵敏度高、特异性好，且能应用于实际检测的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用QCM传感器检测CP4-EPSPs蛋白的方法及专用金片。
技术介绍
草甘膦不仅是一种对于一年生和多年生杂草五中普遍适用的广谱、高效除草剂,而且具有土壤强吸收性和哺乳动物、鸟类、鱼类低毒性等有利于环境的特性。广泛用于果园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理,以及出苗后定向处理,是全世界除草剂使用量最大的品种之一。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)催化倒数第二个莽草酸途径,当底物磷酸烯醇丙酮酸盐有高度亲和性的时候酶表现出高度耐草甘膦特性，在催化合成芳香酸，苯基丙氨酸和酪氨酸时这是关键步骤，也伴随一些吲哚乙酸、木质素和植物抗毒素等次生化合物。是许多抗生素除草剂的首选靶标酶。草甘膦能与植物的EPSPs结合导致植物死亡。从天然的农杆菌菌系CP4中分离的EPSPs酶有很好的抗草甘膦功能，称CP4-EPSPs。全球抗草甘膦作物种植面积呈逐年上升趋势。转基因作物进入市场以来，引起食品安全与控制的普遍警惕。草甘膦的长期使用会影响土壤微生物，加大大豆根部病害几率，而最为严重的是抗草甘膦杂草的出现，因此，掌握科学快速检测抗性杂草的方法以便及对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。目前检测EPSPs基因方法主要有基于核酸水平的PCR法和基于蛋白水平的酶联免疫法和免疫层析试纸条法。阚贵珍等研究结果表明试纸条法中阴性样品一条带阳性样品两条带，PCR检测结果中阳性基因特异片段为146bp。董峰双夹心酶联免疫法结果表明检出限为80ppb。G.J.Rogan用酶联免疫法检测大豆中CP4-EPSPs蛋白的检出限为210μg/g，变异系数小于15%。石英晶体微天平是一种简单，效价高，高分辨率，利用压电效应原理的质量传感技术。免疫学检测法可以检测具有抗原性的蛋白质类表达产物,它是通过抗原-抗体特异性反应来实现的，抗原-抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应,在一般情况下,抗原只和由自己诱导产生的抗体或具有相同抗原决定簇的抗原诱导产生的抗体进行特异性反应。所以,免疫学反应具有高度的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备用于检测CP4-EPSPS的QCM金片的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；2）将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片。上述方法中，上述QCM金片为单侧镀金片，12mm×20mm，单侧镀金50nm，BioNavis公司，货号QSX301-Au-13052。步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备：将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中。步骤1）中，所述浸泡为4℃浸泡12h；上述方法中，步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔比为1:10。上述方法中，所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9M；所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9M。上述方法中，步骤2）中，将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗目的蛋白抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过共价键连接。步骤2）中，所述将抗CP4-EPSPS抗体固定到所述修饰后金片具体按照如下方法制备：先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修饰后金片表面，常温（25℃）下静置2小时；再滴加所述抗CP4-EPSPS抗体，37℃反应3小时；再滴加浓度为1mg/mLBSA，25℃下静置1小时，得到用于检测所述CP4-EPSPS的QCM金片；含有EDC（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）和Sulfo-NHS（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）的溶液：EDC和Sulfo-NHS溶于MES溶液，使EDC在溶液中的终浓度0.075M，NHS在溶液中的终浓度为0.015M。MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：称取3.90g MES溶于180mLddH2O，调节pH至5.0，定容到200mL。上述方法中，所述抗目的蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。上述方法中，所述目的蛋白为抗草甘膦蛋白，所述抗草甘膦蛋白具体为CP4-EPSPS；所述抗目的蛋白抗体为抗CP4-EPSPS单克隆抗体。由上述的方法制备的用于检测目标蛋白的QCM金片也是本专利技术保护的范围；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。上述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测目标蛋白中的应用也是本专利技术保护的范围；所述目的蛋白具体为抗草甘膦蛋白。上述的用于检测目标蛋白的QCM金片在检测抗除草剂转基因植物中的应用也是本专利技术保护的范围；所述除草剂具体为草甘膦。本专利技术的实验证明，本专利技术根据抗原抗体特异性结合的原理，将CP4-EPSPs蛋白单克隆抗体修饰到金片上，通过QCM生物传感器对有抗原性的CP4-EPSPs蛋白特异性检测，可以实现方便快捷，真实可靠，检测过程在两个小时以内，方便实际样品检测，灵敏度高达0.01%，与其他检测方法比较，具有很强的实际应用优势。本专利技术用QCM检测CP4-EPSPs转基因蛋白的方法，可以广泛应用到进出口植物检验检疫工作中，对于转基因检测有着重要的应用价值。作为特异性检测草甘膦转基因蛋白芯片,具有较好的稳定性与保存性,发挥出商业价值。附图说明图1为QCM检测CP4-EPSPs蛋白的灵敏度与重复性图2为QCM检测CP4-EPSPs蛋白的特异性图3为3-MPA和11-MUA共修饰的QCM金片检测实际样品柱形图具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，部分列举如下：石英晶体微天平（Biolin Scientific AB公司）；CP4-EPSPS蛋白（序列1）及抗CP4-EPSPS单克隆抗体（购自北京陆桥质检科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）（上海游然传感科技有限公司）；N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)二亚胺（EDC）（Sigma公司）；N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）（Sigma公司）；脂肪酸甲酯磺酸盐（MES）（上海共价化学科技有限公司）；缓冲液PBS（Sigma公司）；巯基十一酸（11-MUA）和3-巯基丙酸（3-MPA）（上海共价化学科技有限公司）；Tis-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备用于检测目的蛋白的QCM金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3‑巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；2）将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4‑EPSPS的QCM金片。

【技术特征摘要】
1.一种制备用于检测目的蛋白的QCM金片的方法，包括如下步骤：
1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；
2）将抗目的蛋白抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述CP4-EPSPS的
QCM金片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备：
将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸
和所述3-巯基丙酸的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9M；
所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9M。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新，蔡淼，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11