本发明专利技术公开了利用表面活性剂吐温或司盘提高出芽短梗霉中聚苹果酸产量的方法，具体为将出芽短梗霉活化后在含0.1-0.5g/L吐温或司盘的条件下发酵，其方法简单，直接在发酵培养基中加入吐温或司盘即可，可以调节聚苹果酸和普鲁兰多糖合成的碳代谢流向，大幅度提高聚苹果酸产量，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学领域，具体涉及利用表面活性剂吐温或司盘提高聚苹果酸产量的方法。
技术介绍
出芽短梗霉（Aureobasidum pullulan）是一类酵母真菌，具有菌丝体和酵母样两种形态。该菌种在自然界中存在较为广泛。出芽短梗霉发酵高分子产物中主要为聚苹果酸和普鲁兰多糖。聚苹果酸（Polymalic acid）以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。可用于药物缓控释载体、食品加工等领域；普鲁兰多糖（Pullulan）是一种类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，可作为食品领域的增稠剂和被膜剂。通常出芽短梗霉发酵过程会同时产生聚苹果酸和普鲁兰多糖两个大分子代谢产物。聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成共同的前体有葡萄糖-1-磷酸，如碳代谢流进入TCA循环或者乙酸循环积累苹果酸，将最终聚合生成聚苹果酸；而碳代谢流经葡萄糖-1-磷酸转化UDPG-葡萄糖，将最终合成普鲁兰多糖。现有技术报道了0.1%，0.5%和1%的吐温-80能够提高出芽短梗霉产普鲁兰多糖的能力，但是吐温对聚苹果酸产量的影响未见报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用非离子表面活性剂吐温或司盘提高出芽短梗霉中聚苹果酸产量的方法，针对现有聚苹果酸发酵生产工艺技术的不足，结合聚苹果酸和普鲁兰多糖生物合成途径，采用吐温或司盘，对出芽短梗霉代谢流向聚苹果酸。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：提高出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，将出芽短梗霉活化后在含0.1-0.5g/L吐温或司盘的条件下发酵。优选的，所述吐温为吐温-80、吐温-60、吐温-40或吐温-20，所述司盘为司盘-60或司盘-20。优选的，所述发酵是在温度为23-30℃、转速为180-300rpm条件下培养96-150小时；或在温度为23-30℃、转速为300-1000rpm、通气比1:0.8-1:1.6条件下培养72-200小时。更优选的，所述发酵是在温度为25℃、转速为220rpm条件下培养96小时；或在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.2条件下培养96小时。优选的，所述发酵使用的培养基各组分如下：糖50-200g/L，硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠1-5g/L，KH2PO40.005-0.3g/L，ZnSO40.005-0.3g/L，MgSO40.005-0.3g/L，玉米浆0.05-3g/L和CaCO310-50g/L，溶剂为水。优选的，所述出芽短梗霉活化的方法是将出芽短梗霉接种于种子培养基中，然后在温度为23-30℃、转速180-300rpm条件下培养36-96小时；所述种子培养基各组分如下：葡萄糖40-100g/L、硝酸铵1-5g/L、KH2PO40.005-0.3g/L、ZnSO40.005-0.3g/L、MgSO40.005-0.3g/L、玉米浆0.05-0.3g/L和CaCO310-50g/L，溶剂为水。更优选的，所述出芽短梗霉活化的方法是将出芽短梗霉接种于种子培养基中，然后在温度为25℃、转速为220rpm条件下培养96小时；所述种子培养基为葡萄糖90g/L、硝酸钾3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.15g/L、MgSO40.2g/L、玉米浆1g/L和CaCO320g/L，溶剂为水。本专利技术使用的产聚苹果酸菌种为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），保藏号为CCTCC M2012223。也可以使用来源于美国农业部菌种保藏中心（NRRL），美国典型培养物保藏中心（ATCC），中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）等机构保藏或自然分离的Aureobasidium属菌种。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了利用表面活性剂吐温或司盘提高聚苹果酸产量的方法，根据出芽短梗霉合成聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成特点，采用低浓度非离子型表面活性剂吐温或司盘建立定向调控策略，可以实现产物流向聚苹果酸，实现大幅度提高聚苹果酸产量；本专利技术具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸的工业生产。具体实施方式下面将对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本专利技术中从培养液中提取普鲁兰多糖的方法：收集发酵液，将发酵液在4000r/min条件下离心10min，然后收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至相当于上清液体积的1/2后加入的4℃预冷的无水乙醇至乙醇的体积分数为25%，静置于4℃过夜，最后4000r/min离心10min收集沉淀，105℃烘干即可。本专利技术中检测培养液中聚苹果酸的含量的方法：收集发酵液，将发酵液在4000r/min条件下离心10min后取上清1mL，加1mL浓度为2mol/L的H2SO4，然后在90℃水浴中酸水解8小时后，得分析样品。分析样品进行HPLC分析，HPLC流动相0.025mol/L的磷酸二氢钾溶液，检测波长为220nm，流速为0.6mL/min，同时用苹果酸标准品配制标准溶液，通过HPLC检测后绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算聚苹果酸的含量。实施例1取保藏号为CCTCC NO：M2012223的出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）接种于含50mL种子培养基的摇瓶中（摇瓶体积为500mL），在温度为25℃，转速为220rpm条件下培养48小时；然后取培养液按接种量为10%接种于500mL摇瓶中，摇瓶含有50mL含0.1g/L的吐温-80的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为220rpm条件下培养96小时；然后检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为25.69g/L，普鲁兰多糖产量为13.99g/L。同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入吐温-80，发酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，对比实施例中聚苹果酸的产量为21.95g/L，普鲁兰多糖产量为23.04g/L。实施例1与对比实施例相比，聚苹果酸产量提高了17.03%；普鲁兰多糖产量降低了39.28%。本实施例中种子培养基为：葡萄糖60g/L、硝酸铵3g/L、KH2PO40.2g/L、ZnSO40.1g/L、MgSO40.15g/L、玉米浆2g/L和CaCO320g/L，溶剂为水。发本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.提高聚苹果酸产量的方法，其特征在于：将出芽短梗霉活化后在含0.1-0.5g/L吐温或司盘
的条件下发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述吐温为吐温-80、吐温-60、吐温-40或吐
温-20，所述司盘为司盘-60或司盘-20。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵是在温度为23-30℃、转速为
180-300rpm条件下培养96-150小时；
或在温度为23-30℃、转速为300-1000rpm、通气比1:0.8-1:1.6条件下培养72-200小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵是在温度为25℃、转速为220rpm条
件下培养96小时；
或在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.2条件下培养96小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵使用的培养基各组分如下：糖50-200
g/L，硫酸铵、氯化铵、硝酸钾或硝酸钠1-5g/L，KH2PO40.005-0.3g/L，ZnSO40.005-0.3g\...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹祥，涂光伟，王永康，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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