一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶脱色方法技术

本发明专利技术涉及一种新型海洋微生物低温蛋白酶脱色方法,包括：D352阴离子交换树脂的处理,低温碱性蛋白酶MP的制备,低温碱性蛋白酶MP脱色步骤。该D352阴离子交换树脂脱色率为85%-93%；能较好地保留蛋白酶的酶活，酶活保留率为92%-99%；并在连续使用6次之后仍具有较好的脱色功能。脱色后的低温碱性蛋白酶MP能更有效广泛地应用于食品工业、医药工业以及环境工程中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法。 
技术介绍
蛋白酶是三大工业酶之一，其产量达到世界酶制剂产量的60%。由于蛋白酶能有效地去除及分解蛋白，所以其被大量用于洗涤剂行业中。近年来，随着绿色、环保、节能及低碳生活理念的深入，低温洗涤已成为一个趋势。低温碱性蛋白酶MP来自于海洋微生物，具有低温高效的催化性能。但由于蛋白酶发酵液中含有色素，影响了其应用外观品质。离子交换树脂自产生以来,已经广泛应用于食品工业、医药工业以及环境工程的富集、分离、纯化及脱色工艺中。 
技术实现思路
本专利技术的目的在于专利技术人长期开发研究海洋微生物酶的的应用研究及其生产实践,开发提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法。 本专利技术提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP（属海洋微生物低温碱性蛋白酶,或称低温碱性蛋白酶MP,简称蛋白酶MP）脱色方法,包括下列步骤： 1)D352阴离子交换树脂的处理 首先将D352阴离子交换树脂(简称D352树脂)（D352购自上海劲凯树脂有限公司）用4wt%的HCl浸泡2-4h,后用去离子水洗至中性;再用4wt%NaOH浸泡6-8h，去离子水洗至中性，装于离子交换柱中（例如Φ46mm×305mm玻璃离子交换柱等，北京欣维尔玻璃仪器有限公司）,所述D352阴离子交换树脂为大孔型聚苯乙烯带有伯氨基的弱碱型阴离子交换树脂。 2）低温碱性蛋白酶MP的制备 将YS-80菌株接种于含有1.2wt%蛋白胨、2.4wt%酵母粉、0.4wt%甘油、2.5wt%NaCl的GB培养基中,于18℃连续培养48小时，此时检测发酵液中蛋白酶酶活可达到5000U/ml;然后，在4℃条件下，离心去除菌体，保留上清液,再用超滤浓缩的方式制备不同酶活的低温碱性蛋白酶MP酶液; 3）低温碱性蛋白酶MP的脱色 将步骤2制备的低温蛋白酶MP酶液流过步骤1的阴离子交换柱进行脱色，控制流速为4—8BV/ml,优选为6BV/ml;pH值为5—9,优选为6—7;温度为20—40℃,优选为30℃。 本专利技术提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP（阴离子交换树脂）脱色方法中,脱色率的测定： 配制浓度为1wt%的低温蛋白酶MP酶液，进行可见-紫外全波长扫描，发现在420nm有较强的吸收峰，所以选择420nm作为检测波长，测定酶液的吸光度，并按下式计算脱色率。 R=(A-A0)／A0×100 式中： R—脱色率； A0—脱色前吸光度； A—脱色后吸光度。 蛋白酶酶活的测定（Folin-酚法）： 准确称取干酪素1.0g，用少许NaOH或乳酸润湿，溶于50mmol/L一定pH的缓冲液中，调pH，定容至100ml，配成10g/L的酪素溶液。酪素溶液与适当稀释比例的酶溶液预热10min后，各取1.0ml混合于30℃恒温水浴中，准确反应10min，用0.4mol/L三氯乙酸2.0ml终止反应。对照为先加三氯乙酸使酶失活再加酪素。将反应液过滤，取1.0ml于0.4mol/L Na2CO35ml混合，再加1.0ml Folin试剂，震荡混匀，40℃显色20min，于680nm波长处比色。蛋白酶活力以1ml酶液1min水解酪素产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以U/ml表示。 蛋白含量的测定：采用Lorry法。 本专利技术提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法中,海洋微生物低温碱性蛋白酶MP具有低温高效的催化性能，但由于酶液中含有色素，影响了其应用外观品质。将酶液进行脱色是为了增加产品外观的可鉴赏性，在去除色素的同时，必须保证较高的酶活保留率。在广泛研究基础上,筛选了D352阴离子交换树脂用于蛋白酶酶液的脱色。该D352阴离子交换树脂为大孔型聚苯乙烯带有伯氨基的弱碱型阴离子交换树脂,它既能有效地脱色，又能保持较高的蛋白酶酶活。随之测定脱色液在420nm的吸光度，计算脱色率；测定脱色后酶液的蛋白酶酶活，计算脱色后蛋白酶酶活的保留率，结果见图1。该D352阴离子交换树脂既能有效地脱色，又能保持较高的蛋白酶酶活。D352阴离子交换树脂脱色率为88%-93%；能较好地保留蛋白酶的酶活，酶活保留率为91%-99%；该D352阴离子交换树脂在吸附色素的同时也能吸附酶溶液中大量杂蛋白分子，杂蛋白脱除率为45.2%；在连续使用6次之后仍具有较好的脱色功能。脱色的低温蛋白酶MP更有效广泛应用于食品工业、医药工业以及环境工程中。 本专利技术提供一种新型海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法中,对脱色各种因素进行广泛研究： 1.D352阴离子交换树脂对不同酶活酶液的脱色效果和酶活保留率的影响 由于应用领域不同，需要制备不同酶活的酶液。考察了D352阴离子交换树脂在最适条件下对不同低温碱性蛋白酶MP酶活酶液的脱色效果和酶活保留率的影响，实验结果如图1所示。在酶液酶活为0.5-20MU/ml时，D352阴离子交换树脂的脱色率为88-93%，酶活保留率为91-99%，既能有效地脱色，又能保持较高的蛋白酶酶活。 2.pH值对脱色效果和酶活保留率的影响 低温碱性蛋白酶MP酶液的pH值会影响溶液中色素化合物以及树脂中的离子交换解离情况，因此pH值是影响脱色效果的重要因素。pH值过高或过低都不利于蛋白酶的稳定，因此在低温碱性蛋白酶MP酶液的pH值为5-9的范围内进行脱色。结果如图2所示，说明在此条件下，低温碱性蛋白酶MP酶液在pH值为5—9,优选为6和7,脱色率和酶活保留率都很高，中性条件也不影响蛋白酶的酶活,，说明D352阴离子交换树脂与低温碱性蛋白酶MP酶液中的色素离子交换效率高。 3.温度对脱色效果和酶活保留率的影响 一般来说，温度升高，溶液的粘度减少，降低了分子的运动阻力，从而有利于被吸附物质向吸附剂表面的扩散。但低温碱性蛋白酶MP是一种低温蛋白酶，温度超过40℃，蛋白酶MP会失活。考虑这两种因素，在20℃—40℃考察D352阴离子交换树脂的脱色效果。如图3所示，随着温度的升高，低温碱性蛋白酶MP酶液的脱色率从25℃的90%增加到40℃时的94%，说明温度对脱色率的影响较小。但随着温度的升高，低温碱性蛋白酶MP酶液的酶活却降低明显，从30℃的99%降低到40℃的80%，所以,最适脱色温度为20—40℃,优选为30℃。 4.流速对脱色效果和酶活保留率的影响 D352阴离子交换树脂的脱色能力与低温碱性蛋白酶蛋白酶MP酶液通过柱子的流速有很大关系，流速越快，树脂与酶液接触时间越短，不能充分与其中色素进行离子交换，因而脱色效果较差；低流速时，树脂与酶液充分接触，脱色效果明显提高；但酶液与树脂的接触时间过长，树脂中的离子可能会影响蛋白酶的活性，从而造成酶活保留率降低。综合两种因素，脱色最适流速为4—8BV/h（1BV=5ml）,优选为6BV/h（图4）。 5.脱色前后的蛋白质含量变化 脱色前低温碱性蛋白酶蛋白酶MP酶液棕色较浑浊，蛋白质含量为12.56mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法,其特征在于包括下列步骤：1）阴离子交换树脂的处理将大孔型聚苯乙烯带有伯氨基的弱碱型阴离子交换树脂用4wt%的HCl浸泡2‑4h,后用去离子水洗至中性;再用4wt%NaOH浸泡6‑8h，去离子水洗至中性，装于离子交换柱中;2）低温碱性蛋白酶MP的制备将YS‑80菌株接种于含有1.2wt%蛋白胨、2.4wt%酵母粉、0.4wt%甘油、2.5wt%NaCl的GB培养基中,于18℃连续培养48小时，此时检测发酵液中蛋白酶酶活可达到5000U/ml;然后，在4℃条件下，离心去除菌体，保留上清液,再用超滤浓缩的方式制备不同酶活的低温碱性蛋白酶MP酶液;3）低温碱性蛋白酶MP的脱色将步骤2制备的低温碱性蛋白酶MP酶液流过步骤1的离子交换柱进行脱色，控制流速为4—8BV/ml,pH值为5—9,温度为20—40℃。

【技术特征摘要】
1.一种海洋微生物低温碱性蛋白酶MP脱色方法,其特征在于包括下列步骤：
1）阴离子交换树脂的处理
将大孔型聚苯乙烯带有伯氨基的弱碱型阴离子交换树脂用4wt%的HCl浸泡2-4h,
后用去离子水洗至中性;再用4wt%NaOH浸泡6-8h，去离子水洗至中性，装于离子交
换柱中;
2）低温碱性蛋白酶MP的制备
将YS-80菌株接种于含有1.2wt%蛋白胨、2.4wt%酵母粉、0.4wt%甘油、
2.5wt%NaCl的GB培养基中,于18℃连续培养48小时，此时检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，孙谧，徐甲坤，刘均忠，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37