一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法，该方法主要包括以下步骤：采用BaCl2-乙醇法对酪蛋白磷酸肽原料进行纯化；采用高效液相色谱法对纯化后的酪蛋白磷酸肽原料进行标准曲线的绘制；采用固相萃取对乳制品样品进行纯化后，用高效液相色谱法对其进行检测，得到检测结果。本发明专利技术的检测方法简化了操作步骤，缩短了检测时间，尤其可以对低酪蛋白磷酸肽含量的乳制品进行更有效、更精准的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种乳制品中功能性成分的检测方法，尤其涉及一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法，属于检测

技术介绍
酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，简称CPP)是以牛奶酪蛋白为原料经蛋白酶水解，再经分离纯化而得到的含有磷酸丝氨酸族的天然生理活性肽，具有结合钙和促进钙吸收的功能，所以又被称为促钙吸收因子。目前国内外对CPP原料中CPP含量的检测方法一般采用BaCl2-乙醇法，且乳制品中CPP的含量完全靠诚信添加。国内报道的对乳制品中CPP的检测方法主要包括毛细管区带电泳法、液相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法(HPLC)。毛细管区带电泳法的干扰因索较多，不适于低含量CPP的检测；液相色谱-质谱联用法检测成本高，不适于生产车间对产品的检测；已报道的高效液相色谱法的文献中没有提到乳制品的纯化方法，且在市面上无法买到CPP标准品，故该检测方法在实际应用中很难重复。目前检测CPP成品中的CPP含量时，要先用BaCl2-乙醇法检测CPP原料中CPP的含量，再以该CPP原料的添加量来推算成品中的CPP含量，过程操作步骤繁琐，耗时较长，一般需要2-3天才可以得到检测结果，且检测结果误差较大，不适于现代化生产的要求。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法。该检测方法首先对CPP原料进行纯化，将其作为标准品，再对经纯化的CPP>成品进行检测，得到检测结果。该检测方法简化了操作步骤，缩短了检测时间，可以准确、有效的检测出乳制品中酪蛋白磷酸肽的含量。为达上述目的，本专利技术提供一种乳制品中酪蛋白磷酸肽的检测方法，其包括以下步骤：A、酪蛋白磷酸肽原料的纯化将酪蛋白磷酸肽原料溶解后，调整pH值为4.6，定容为0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液，静置30min；将上述溶液在4℃、5000rpm离心15min，取上清液，加入BaCl2使其浓度为0.05M，混匀后，得到一含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液；以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶无水乙醇＝1∶2的体积比，在上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入无水乙醇，混匀后，在4℃静置12-16小时；将上述静置后的溶液在4℃、5000rpm离心15min，弃去上清液，以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶H2SO4＝1∶0.4的体积比，在沉淀中加入浓度为0.125M的H2SO4，然后用滤纸过滤；取滤液在60-70℃烘干60min，之后在105℃烘干至恒重，得到纯化的酪蛋白磷酸肽原料；B、标准曲线的绘制将上述纯化的酪蛋白磷酸肽原料用超纯水制备浓度为0.1mg/100mL、0.5mg/100mL、1mg/100mL、5mg/100mL、10mg/100mL、20mg/100mL的系列标准工作液，采用高效液相色谱仪对该系列标准工作液进行检测分析，绘制标准曲线；C、酪蛋白磷酸肽成品的检测C1、样品纯化C1.1、提取当样品为液态乳制品时：称取20g样品，用浓度为1％的三氯乙酸(质量浓度1％的三氯乙酸水溶液)定容至50mL，超声10min，静置过滤得待净化液，其中，本领域一般技术人员可以根据实际情况对所述静置步骤的时间进行调控，优选地，所述静置的时间为10分钟；所述过滤步骤所使用的滤纸可以为常规的定性滤纸；当样品为固态乳制品时：称取5g样品，用浓度为1％的三氯乙酸溶解后定容至50mL，超声10min，静置过滤得待净化液，其中，本领域一般技术人员可以根据实际情况对所述静置步骤的时间进行调控，优选地，所述静置的时间为10分钟；所述过滤步骤所使用的滤纸可以为常规的定性滤纸；C1.2、净化将固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取适当体积的待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，弃去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脱至10mL具塞试管中，整个固相萃取过程流速不超过1mL/min，将洗脱液于50℃下用氮气吹干，得到残留物；C2、检测及计算将吹干后得到的残留物用适当体积流动相A定容，过微孔滤膜后，将得到的上清液采用高效液相色谱仪进行检测，根据标准曲线及样品的峰面积计算出样品中的酪蛋白磷酸肽含量。由于CPP原料纯度低的问题，很少有使用CPP原料作为标准品对成品进行检测的，但是，鉴于目前国内外市面上无法获得CPP标准品，因此，本专利技术采用BaCl2-乙醇法对CPP原料进行了纯化，将其作为检测CPP成品的标准品。在上述检测方法的酪蛋白磷酸肽原料的纯化步骤中，可以采用盐酸调整CPP原料水溶液的pH值至4.6，使酪蛋白沉淀，其中，盐酸的浓度及添加量可以在顺利进行反应的前提下由本领域一般技术人员进行常规的选择及调控；此外，定容为0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液只是为了方便后续的计算，但是也可以不将酪蛋白磷酸肽原料溶液的浓度定容为0.2g/mL，只要该浓度下得到的纯化的CPP原料能顺利制备后续的系列标准工作液即可；在上述CPP原料的纯化步骤中，采用两次离心可以更好地除去杂质，使得到的CPP标准品的纯度更高。在上述检测方法中，所采用的高效液相色谱仪及其流动相与色谱条件均可以为检测酪蛋白磷酸肽含量时常规采用的。优选地，所述高效液相色谱仪为色谱柱为C18250×4.6mm，5μm的高效液相色谱仪。所采用的流动相A可以为色谱纯乙腈。在上述检测方法中，所采用的固相萃取柱及固相萃取装置均为常规的；优选地，所采用的固相萃取柱为强阳离子交换柱(SCX)。根据本专利技术的具体实施方式，在没有经过固相萃取纯化的样品的高效液相色谱图上在标志峰附近也有峰出现，而经过固相萃取纯化的样品的高效液相色谱图上则少了很多干扰峰。而且，采用固相萃取法将乳制品样品进行纯化，将较纯的CPP提取出来后再进行检测，可以对低CPP含量的乳制品进行更有效、更精准的检测。因此，本专利技术采用固相萃取技术对含CPP的乳制品样品进行纯化，可以有效的将CPP与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力，达到了减少样品中的其他物质对检测造成干扰，进而提高检测的准确度的效果。在上述检测方法中，优选地，所述过微孔滤膜的孔径为0.2μm。在上述检测方法中，优选地，在所述酪蛋白磷酸肽成品的检测步骤中，转移至固相萃取小柱中的待净化液的体积与用于定容残留物的流动相A的体积相同。在上述检测方法中，优选地，所述转移至固相萃取小柱中的待净化的体积与用于定容残留物的流动相A的体积均为6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法，其包括以下步骤：A、酪蛋白磷酸肽原料的纯化将酪蛋白磷酸肽原料溶解后，调整pH值为4.6，定容为0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原料溶液，静置30min；将上述溶液在4℃、5000rpm离心15min，取上清液，加入BaCl2使其浓度为0.05M，混匀后，得到一含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液；以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶无水乙醇＝1∶2的体积比，在上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入无水乙醇，混匀后，在4℃静置12‑16小时；将上述静置后的溶液在4℃、5000rpm离心15min，弃去上清液，以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶H2SO4＝1∶0.4的体积比，在沉淀中加入浓度为0.125M的H2SO4，然后用滤纸过滤；取滤液在60‑70℃烘干60min，之后在105℃烘干至恒重，得到纯化的酪蛋白磷酸肽原料；B、标准曲线的绘制将上述纯化的酪蛋白磷酸肽原料用超纯水制备浓度为0.1mg/100mL、0.5mg/100mL、1mg/100mL、5mg/100mL、10mg/100mL、20mg/100mL的系列标准工作液，采用高效液相色谱仪对该系列标准工作液进行检测分析，绘制标准曲线；C、酪蛋白磷酸肽成品的检测a、样品纯化a1、提取当样品为液态乳制品时：称取20g样品，用浓度为1％的三氯乙酸定容至50mL，超声10min，静置过滤得待净化液；当样品为固态乳制品时：称取5g样品，用浓度为1％的三氯乙酸溶解后定容至50mL，超声10min，静置过滤得待净化液；a2、净化将固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，取适当体积的待净化液转移至固相萃取小柱中，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，弃去淋洗液后用6mL氨化甲醇洗脱至10mL具塞试管中，整个固相萃取过程流速不超过1mL/min，将洗脱液于50℃下用氮气吹干，得到残留物；b、检测及计算将吹干后得到的残留物用适当体积流动相A定容，过微孔滤膜后，将得到的上清液采用高效液相色谱仪进行检测，根据标准曲线及样品的峰面积计算出成品中的酪蛋白磷酸肽含量。...

【技术特征摘要】
1.一种乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的检测方法，其包括以下步骤：
A、酪蛋白磷酸肽原料的纯化
将酪蛋白磷酸肽原料溶解后，调整pH值为4.6，定容为0.2g/mL的酪蛋白磷酸肽原
料溶液，静置30min；
将上述溶液在4℃、5000rpm离心15min，取上清液，加入BaCl2使其浓度为0.05M，
混匀后，得到一含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液；
以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶无水乙醇＝1∶2的体积比，在上述含有
BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液中加入无水乙醇，混匀后，在4℃静置12-16小时；
将上述静置后的溶液在4℃、5000rpm离心15min，弃去上清液，以上述含有BaCl2的酪蛋白磷酸肽原料溶液∶H2SO4＝1∶0.4的体积比，在沉淀中加入浓度为0.125M的
H2SO4，然后用滤纸过滤；
取滤液在60-70℃烘干60min，之后在105℃烘干至恒重，得到纯化的酪蛋白磷酸肽
原料；
B、标准曲线的绘制
将上述纯化的酪蛋白磷酸肽原料用超纯水制备浓度为0.1mg/100mL、0.5
mg/100mL、1mg/100mL、5mg/100mL、10mg/100mL、20mg/100mL的系列标准工作
液，采用高效液相色谱仪对该系列标准工作液进行检测分析，绘制标准曲线；
C、酪蛋白磷酸肽成品的检测
a、样品纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁艳，王艳萍，任新志，邵振国，
申请(专利权)人：内蒙古伊利实业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15