本发明专利技术公开了一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾2-4g/L、亚硫酸6-8ml/L、四硼酸钠0.5-1.5g/L、碳酰二胺2-4g/L、硝酸银8-10mg/L。该配方配制的培养液，用于培养授过玉米花粉、从盆钵或田间剪回室内的小麦穗，诱导产生小麦单倍体胚；在所有其它条件不改变的情况下，改用该配方后单倍体胚的诱导率可比用现有的穗培养液再提高10-15个百分点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业生物化学
，涉及一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法。
技术介绍
Zenkteler(1984)、Laurie等(1986)建立的玉米花粉诱导小麦单倍体技术，通过20多年的研究，目前已成为产生小麦单倍体效率最高的途径之一。小麦单倍体在筛选基因突变体、基因功能研究等方面具有重要应用价值，加倍单倍体在基因定位、构建连锁遗传图谱、固定杂种优势、加速小麦育种进程等方面具有重要应用价值。单倍体胚诱导率，也称成胚率、得胚率，是指用玉米花粉每授粉100个去雄的小麦小花能得到的小麦单倍体胚个数，它是判断小麦玉米杂交单倍体胚诱导效率的主要技术指标，也是决定该单倍体胚诱导技术能否在小麦育种上应用的关键指标之一。单倍体胚诱导率受小麦基因型、玉米基因型、玉米花粉的质量、激素处理方法、授粉后的生长条件(包括自然条件和营养条件)等多种因素的影响。目前绝大多数报道的单倍体胚诱导率只有15％-25％，成本较高，只是在极少数小麦材料上可达到30％-40％，个别材料最高为59％，单倍体胚诱导率不稳定，时低时高。因此获得较高而且稳定的单倍体胚诱导率，是小麦玉米杂交单倍体胚诱导技术在小麦育种上广泛应用必须解决的关键问题之一。Riera-Lizarazu(1992)、Suenaga(1997)、Inagaki(1997)、Cherkaoui(2000)、Inagaki(1997，1998)、Mujeeb-Kazi(2006)、Muhammad Ahsan Khan(2011)、Makhdoom Hussain(2012)等将授过玉米花粉的麦穗剪回室内插在穗培养液中并置于室内人工控制的温度、湿度、光照条件下进行离体培养，最大限度地减少了外界复杂多变的自然因素对单倍体胚诱导、发育的影响，较好地解决了单倍体胚诱导率的稳定性问题，但大多数小麦材料的单倍体胚诱导率较低的问题仍未解决。离体培养时，由于麦穗在脱离母体植株后还要继续生长13天以上，在此期间要保证麦穗维持正常的生理生化功能，产生更多的单倍体胚、保证单倍体胚不夭亡，穗培养液是其最主要的外部营养来源，因此穗培养液的质量至关重要。在世界绝大多数地区，小麦和玉米两种作物都不能同季种植，小麦在冬春季节种植，而玉米则在春夏季种植，给该技术的进一步研究完善带来诸多不便。而云南多数地区的夏季，春性、弱春性、半冬性小麦与玉米都可在夏季同季种植，为研究完善该技术提供了便利条件。2000年以来我们利用云南的自然优势开展了60余项试验研究，也报道了一些研究结果，包括高诱导率玉米基因型、高效授粉方法和激素处理方法、改进的穗培养液配方等。关于穗培养液配方，2008年我们用自主改进配方(2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+硝酸银10mg/L+亚硫酸8ml/L+磷酸二氢钾3g/L)与国内外报道的以下3种主要穗培养液配方进行了比较研究：配方A：2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+亚硫酸8ml/L(Inagaki，1997；蔡华等，2005；Mujeeb-Kazi，2006；Muhammad Ahsan Khan，2011；Makhdoom Hussain，2012)；配方B：2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+硝酸银10mg/L+亚硫酸8ml/L(Inagaki，1998)；配方C：2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+乙醇10ml/L(Najia Saidi，1997；Cherkaoui，2000)结果自主改进配方的单倍体胚诱导率基本稳定在30％左右(加权平均31.35％)，优于其他3种配方，其中用配方C在两年两个试验点的单倍体胚诱导率均为0，详细结果见《麦类作物学报》2008年第1期第1-5页。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法，涉及高频率诱导小麦产生单倍体胚，该单倍体胚通过胚培养，可产生小麦单倍体苗，对单倍体苗进行染色体加倍，可获得加倍单倍体(Doubled haploid，简称DH)植株。其技术方案如下：一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸(别名2，4-D)100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾2-4g/L、亚硫酸6-8ml/L、四硼酸钠0.5-1.5g/L、碳酰二胺2-4g/L、硝酸银8-10mg/L。进一步优选，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖40g/L、磷酸二氢钾3g/L、亚硫酸8ml/L、四硼酸钠1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸银9mg/L。进一步优选，用该配方配制培养液时，所用水的最低质量要求为符合国家《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的自来水；所用蔗糖、磷酸二氢钾、亚硫酸、四硼酸钠、碳酰二胺的最低纯度要求为化学纯；所用2，4-二氯苯氧乙酸和硝酸银的纯度要求为分析纯。进一步优选，所述麦穗离体培养液配制完成后需盛于深色容器保存备用。本专利技术所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方的制备方法，包括以下步骤：(1)称取100mg的2，4-二氯苯氧乙酸于烧杯，加入60ml浓度为0.1N的氢氧化钠，用玻棒或搅拌器搅拌，使2，4-二氯苯氧乙酸完全溶解；(2)用容量为1000ml的容器量取600ml自来水，按权利要求1所述配方中各化合物的用量，依次加入蔗糖、磷酸二氢钾、四硼酸钠、碳酰二胺、亚硫酸、硝酸银，和已溶解的2，4-二氯苯氧乙酸；(3)加自来水定容到1000ml，摇匀，倒入深色容器常温保存备用。本专利技术所述的小麦单倍体胚是指通过玉米花粉给普通小麦授粉的途径来诱导小麦产生的未进行人工染色体加倍的单倍体胚；本专利技术所述的麦穗离体培养是指从田间或盆钵中剪取授过玉米花粉的麦穗插入盛有穗培养液的器皿中在室内进行昼夜连续培养。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：用该配方培养的麦穗，到培养结束的14天，茎、叶、穗仍保持绿色，即仍能维持正常的生理生化功能，且颖果结实率高，发育饱满；相比之下自主改进配方到此时茎、叶、穗已基本变黄，说明到培养结束前几天其茎、叶、穗的生理生化功能已开始衰退。因此利用本专利技术提供的新培养液配方，在其它条件不改变的情况下，其单倍体胚诱导率比用此前的自主改进配方平均至少提高了5个百分点，比国内外报道的其它配方平均至少提高了10个百分点，这在批量生产小麦加倍单倍体中，可进一步提高效率，降低成本。...
【技术保护点】
一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4?二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35?45g/L、磷酸二氢钾2?4g/L、亚硫酸6?8ml/L、四硼酸钠0.5?1.5g/L、碳酰二胺2?4g/L、硝酸银8?10mg/L。
【技术特征摘要】
1.一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，该配方由以
下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾
2-4g/L、亚硫酸6-8ml/L、四硼酸钠0.5-1.5g/L、碳酰二胺2-4g/L、硝酸银8-10mg/L。
2.根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征
在于，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖40g/L、
磷酸二氢钾3g/L、亚硫酸8ml/L、四硼酸钠1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸银9mg/L。
3.根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征
在于，用该配方配制培养液时，所用水的最低质量要求为符合国家《生活饮用水卫生标准》
GB5749-2006的自来水；所用蔗糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨木军，顾坚，李绍祥，刘琨，李宏生，田玉仙，赵红，杨和仙，丁明亮，
申请(专利权)人：云南省农业科学院粮食作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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