一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法。用Oasis MCX固相萃取小柱对尿液样品进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化，对醇羟基进行mosher酯化，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测，进而换算出尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度，然后计算两者的比例。该方法可以为评估个体对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢健康状况以及评价对烟气中这些物质的暴露程度提供一种科学的判定方法，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点，填补了这一技术领域的空白。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。用Oasis?MCX固相萃取小柱对尿液样品进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化，对醇羟基进行mosher酯化，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测，进而换算出尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度，然后计算两者的比例。该方法可以为评估个体对尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL的代谢健康状况以及评价对烟气中这些物质的暴露程度提供一种科学的判定方法，具有检测限低、稳定性好、快速准确等优点，填补了这一
的空白。【专利说明】—种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法
本专利技术属于烟草生物碱理化检验
，具体涉及。
技术介绍
近年来，随着人们对吸烟与健康问题的广泛关注，国内外烟草行业以及卫生机构迫切需要建立一些准确评价不同人群对烟草中部分化学成分暴露程度的方法，而生物标志物法是一种公认且有效的监测各种人群暴露程度的方法。目前，国内外检测各种具体烟气化学成分在人体尿液中生物标志物的研究已经有一些报道，但数量还比较少，涉及的用途也比较窄。研究结果显示烟草中有3000多种化学物质，烟气中有5000多种化学物质，其中相当一部分化学物质的化学结构比较相近，它们进入人体后又经过各种复杂的代谢途径，很可能代谢生成同一种物质从尿液中排出。例如:尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等化学结构相近，都可以经过各种代谢途径生成4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸经尿液排出体外。虽然这些物质的初始代谢途径可能差异很大，但它们经过各种代谢途径都可以生成4-羰基-4-(3-吡啶基)丁酸，后者可以再进一步被加氢还原酶还原为羟基，生成一对4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸对映异构体，分别为(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸。由于人体本身就是一个不对称化学反应的有机系统，所以普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度有明显的差异，研究结果显示，(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度大约是(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的30~160倍。由于普通人群尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比例比较稳定，而其初级前体物质尼古丁、降烟碱、NNK和NNAL等与吸烟的数量或烟气的可致肺癌性相关，所以尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R`)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的浓度比值必然反映出人体相关器官的解毒能力以及受到NNK和NNAL等有害成分的损害程度，因此检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量以及比值具有重要意义。如何实现同时对尿样中两种4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的准确检测并对两者的比值进行深入分析，现有技术中尚未有很好的解决办法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过高效液相色谱-质谱-质谱联用技术准确检测尿液中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸含量的方法，通过对两者的比值进行深入分析，为评估个体对烟气暴露程度提供一种科学的判定方法。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为重量百分数。—种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤:(I)配制含有(±) -4-羟基-4- (3-吡啶基)丁酸和氘代(±) -4-羟基_4_ (3_吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；(2)用普通健康吸烟人群尿样中(R)-4-mosher酯基-4-(3-卩比唳基)丁酸甲酯浓度远大于(S)-4-mosher酯基_4_(3_卩比唳基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-4-m0sher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；(3)准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5内标溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测。该方法具体包括以下步骤:(I)标准曲线建立:以无水乙腈为溶剂，配制(±) 4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；按同样方式配制(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂配制含有(±)-4_羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(±)-4_羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制(S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液；配制三乙基胺的无水乙腈溶液；分别取混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中，在-20°C氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再加入(S) - (+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；外消旋体4-mosher酯基_4_(3_吡啶基)丁酸甲酯标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1 ; WHPLC-MS-MS色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的浓度与(S)-4-mosher酯基-4-(3-卩比唳基)丁酸甲酯_d5的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量离子对峰面积与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯_d5的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-4-mosher酯基_4_(3_吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；以同样方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；(2)尿液样品处理:准确移取尿样于试管中，加入(±)-4_羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀待用；将混匀后的尿样上样到已经活化好的混合阳离子树脂固相萃取小柱上进行净化，用去离子水淋洗后抽干、稀盐酸淋洗后抽干、甲醇淋洗后抽干，最后用甲醇:25%氨水混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干，加入无水乙醚，在-20°C氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入⑶-(+) - α -甲氧基-α -三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，待检测；(3) HPLC-MS-MS 检测条件:液相条件:用C18色谱柱和乙腈-乙酸水溶液对样品进行分离；质谱条件:用正离子模式(APCI+)进行多反应检测(MRM)，分析物特征离子对如表I ;表1分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测尿液中4‑羟基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）配制含有(±)‑4‑羟基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸和氘代(±)‑4‑羟基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸‑d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC‑MS‑MS分析;（2）用普通健康吸烟人群尿样中(R)‑4‑mosher酯基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸甲酯浓度远大于(S)‑4‑mosher酯基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)‑4‑mosher酯基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸甲酯和(R)‑4‑mosher酯基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；（3）准确移取尿液样品于试管中，加入(±)‑4‑羟基‑4‑(3‑吡啶基)丁酸‑d5内标溶液和醋酸‑醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC‑MS‑MS检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋举兴，者为，王文元，段焰青，夏建军，党立志，陈兴，
申请(专利权)人：红云红河烟草集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53