本发明专利技术公开了一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，其包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体，采用本发明专利技术的肿瘤蛋白P185检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的肿瘤蛋白P185水平，其灵敏度和精密性高，测试重复性好。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，其包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体，采用本专利技术的肿瘤蛋白P185检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的肿瘤蛋白P185水平，其灵敏度和精密性高，测试重复性好。【专利说明】肿瘤蛋白P185检测试剂盒
本专利技术涉及生物学和医学检验领域，具体是涉及一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒。
技术介绍
P185是由癌基因HER-2/neu编码的一种重要的肿瘤表面标记蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症患者中均显示有过量表达，P185过量表达的患者肿瘤恶性程度高，术后易发生转移和复发，并且对化疗药物治疗具有抗性，因此检测肿瘤抗原P185的表达水平，对多种肿瘤的鉴别诊断、分类预示疗效以及治疗方案的选择均有重要意义，尤其是乳腺癌，P185已是国际公认的一个重要的临床指标。与检测肿瘤组织中肿瘤蛋白P185的表达相比，检测病人血清中肿瘤蛋白P185的表达简便易行，适合临床需要，但是目前国内尚未建立检测患者的血清中P185的试剂盒，因此研发出高灵敏性、高特异性及稳定性的P185检测试剂盒，用于乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症血清中P185的检测，这对上述肿瘤的筛查、诊断与治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，该检测试剂盒精密性高、稳定性好。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是:一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，其特征在于:包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体。更为具体的方案为:所述的包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体2Dn，所述的生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体为肿瘤蛋白P185单克隆抗体3F9，肿瘤蛋白P185单克隆抗体2Dn、3F9的制备步骤如下:a)以NIH/3T3细胞1.p免疫第一批6?8周的Balb/C雌鼠，得到雌鼠的抗NIH/3T3血清；b)收集长至汇合的T6-17细胞，用PBS缓冲液洗三次，将上述制备的抗NIH/3T3抗血清用PBS缓冲液以1:20?100稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4°C条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管8-10次，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞1.P免疫第二批6_8周的BaLb/C雌鼠，然后取雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合；e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2Dn、杂交瘤细胞株3F9。所述的洗涤液是由28.8g 的 Na2HP04.12H20、80g 的 NaCl、3.9g 的 NaH2P04.2Η20和50ml的Tween-20加入纯化水溶解定容至100000ml所得。所述的显色底物包括显色液A和显色液B，所述的显色液A是用柠檬酸缓冲液将30%过氧化氢稀释1000倍所得，所述的显色液B为用含20% 二甲基亚砜的柠檬酸缓冲液将四甲基联苯胺配制成0.4mg/ml所得。所述的终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。所述的阳性对照品、阴性对照品分别为人体的P185阳性血清、P185阴性血清。本专利技术在常规酶联免疫吸附试验的基础上，通过生物素与辣根过氧化物酶-链亲和素之间的高度放大作用，建立了一种高灵敏度生物素-亲和素-酶联免疫检测试剂盒，以测定待测样中的肿瘤蛋白P185表达水平。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力，其结合常数高达ΙΟΙδΜ—1 ；所述的生物素很易与抗体等蛋白质以共价键结合，这样结合有酶的辣根过氧化物酶-链亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应的显色底物时发生催化作用而呈色，从而达到检测目标抗原或抗体分子的目的，采用本专利技术的肿瘤蛋白Ρ185检测试剂盒可以有效、稳定地测定人体血清中的肿瘤蛋白Ρ185水平，其灵敏度高，测试重复性好。【专利附图】【附图说明】图1、2是肿瘤蛋白单克隆抗体2Dn和3F9纯化前后的SDS-PAGE分析结果；图3是肿瘤蛋白单克隆抗体2Dn识别抗原的SDS-PAGE及Western blot分析结果;图4是四个肿瘤标本的免疫组织化学染色示意图。【具体实施方式】以下对肿瘤蛋白P185检测试剂盒的制备、使用步骤以及使用效果做进一步的说明:1、肿瘤蛋白P185检测试剂盒的制备I)常规器材及试剂的准备:96孔酶标板、P185阳性血清、P185阴性血清、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶-链亲和素以及显色液A、显色液B，其中P185阳性血清和P185阴性血清的符合率达100%。2)肿瘤蛋白P185单克隆抗体的制备:a)收集NIH/3T3细胞1.p免疫第一批6?8周的Balb/C雌鼠，NIH/3T3细胞的每次使用剂量为IO7/只，每隔两周一次，三次后从雌鼠尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的NIH/3T3细胞进行1.P免疫，七天后从该雌鼠的眼窝取血，即得雌鼠的抗NIH/3T3血清；b)收集长至汇合的T6-17细胞，采用PBS缓冲液(即磷酸盐缓冲液)洗三次，所述的T6-17细胞为转染Her-2/neu癌基因的NIH/3T3细胞，其膜表面高表达肿瘤蛋白P185，将上述制备的抗NIH/3T3血清用PBS缓冲液以1:50的比例稀释，然后取2ml加入T6-17细胞中，在4°C条件下温育过夜，期间晃动盛放T6-17细胞的试管9次以使细胞悬浮，然后再用PBS缓冲液洗三次，得到悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞；c)用上述悬浮于PBS缓冲液中的T6-17细胞1.P免疫第二批6_8周的BaLb/C雌鼠，剂量为IO7/小只，在第I周、第3周和第6周各一次，第7周从雌鼠的尾部取血，用ELISA法测血清滴度，将滴度最高的雌鼠再用同量的T6-17细胞1.P免疫，三天后取该雌鼠的脾细胞制成细胞悬液；d)将步骤c得到的细胞悬液与骨髓瘤细胞SP2/0混合，并在融合剂PEG的作用下进行细胞融合，所述的骨髓瘤细胞SP2/0由中国科学院上海细胞库提供；e)用ELISA法从上述融合的细胞中筛选出分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化，从而得到两株具有稳定分泌肿瘤蛋白P185单克隆抗体能力的杂交瘤细胞株，分别命名为杂交瘤细胞株2Dn和杂交瘤细胞株3F9，f)将杂交瘤细胞株2Dn和3F9分别注入不同的雌鼠体内，收集腹水,采用Prote本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤蛋白P185检测试剂盒，其特征在于：包括肿瘤蛋白P185单克隆抗体、酶标板、阳性对照品、阴性对照品、洗涤液、终止液、辣根过氧化物酶‑链亲和素及其显色底物，所述的肿瘤蛋白P185单克隆抗体包括包被在酶标板上的肿瘤蛋白P185单克隆抗体和生物素标记的肿瘤蛋白P185单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋礼华，徐振山，周业亭，吴强，
申请(专利权)人：安徽安科生物工程集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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