一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法。其方法包括如下步骤：S1.待测偃麦草属植物基因组DNA提取；S2.设计Ee基因组PCR扩增特异引物及PCR扩增；S3.将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测及鉴定。本发明专利技术引物的应用，具有准确性高、结果稳定、不受环境条件和植物发育时期等影响的特点，可以快速、准确地鉴定多倍体偃麦草属植物是否具有Ee基因组。本发明专利技术解决以往基因组原位杂交技术、特异序列的荧光原位杂交、全基因组Southern杂交鉴定基因组方法的操作繁锁、人为因素影响大、费用高以及基因组特异RAPD片段鉴定基因组的方法易受基因组重复序列影响，稳定性不高等问题，具有操作简单、扩增产物单一、重复性高、模板DNA用量少、经济快捷。

【技术实现步骤摘要】
一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法。
技术介绍
小麦是世界重要的粮食作物，近年来我国耕地面积下降，小麦品种遗传背景狭窄，导致小麦总产和单产出现了下降的严重局面。品种选育与推广是提高粮食单产的主要途径。要实现新品种选育上的重大突破，则必须依赖育种新材料的创制和利用，以及育种技术的创新，其重要基础就是要发掘和创新种质资源，加强对重要资源的评价和利用研究。小麦近缘野生植物含有丰富的优良基因，是小麦品质改良的巨大基因库。偃麦草属(Elytrigia Desv.)是多年生小麦野生近缘属，隶属于禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)0全世界偃麦草属约有50种，分布于温带和寒带地区，我国有10种，其中6种有栽培历史，主要分布于华北和西北地区。该属植物适应性强，繁殖能力强，常作牧草，其中多个种是小麦远缘杂交的重要亲本材料，是白粉病、叶锈病、条锈病及黄矮病等的重要抗源，对蚜虫的抵抗力也很强，还有多花、长穗、籽粒蛋白含量高以及耐低磷营养胁迫、耐寒、耐旱等优良性状，是小麦育种利用最成功的小麦近缘种属之一。偃麦草属植物基本染色体组为St和E (Ee，Eb)基因组，St基因组来自于拟鹅草属(Pseudoroegneria)植物，Ee、Eb是同一个基因组的两个变型，Ee基因组来自于二倍体长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum) , Eb基因组来自二倍体比萨偃麦草(Thinopyrumbessarabicum)。偃麦草属多倍体植物由这三个基本基因组构成，但多倍体植物的基因组构成较为复杂，一些物种的染色体组仍然没有一致的结论，存在争论。已有研究发现St基因组和E% Eb基因组的染色体间可以发生大量的配对，基因组原位杂交时会发生交叉杂交，表明St基因组和E6、Eb基因组具有较高的相似性，所以当用St基因组DNA作探针，E基因组DNA作封阻对倍性较高的偃麦草属植物进行原位杂交时，会出现所有染色体都有杂交信号，反之，用E基因组DNA作探针，St基因组DNA作封阻，也出现所有染色体都有杂交信号。因此，新的、更有效的方法对St和E% Eb基因组进行鉴定，认识多倍体偃麦草属植物的基因组组成，将有助于理清偃麦草属植物的基因组组成和进化历史，对远缘杂交育种中外源遗传物质导入后的检测很有意义。目前偃草属植物基因组组成复杂，St、Ee和Eb基因组同源性高，从而限制了偃麦草属植物在育种中的利用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法。本专利技术快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法，其方法包括如下步骤:S1、待测偃麦草属植物的基因组DNA提取:(1)取待测偃麦草属植物幼嫩叶片3_5g，于液氮中研磨至粉末状，放入50mL离心管中；(2)加入15mL预热至65°C的2XCTAB缓冲液，轻摇混匀，65°C水浴保温30min，其间轻轻摇匀几次；(3)加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，摇匀至上清液呈乳白色，4°C、10，OOOg离心lOmin，取上清；(4)重复以上步骤，至分界面澄清；(5)加入等体积预冷异丙醇,摇匀,放入_20°C冰箱沉淀30min ；(6)勾出DNA沉淀，用70%酒精洗2-3次，无水乙醇洗1-2次；(7)风干后，将DNA溶于TE溶液，置于_20°C冰箱中备用。S2、设计PCR扩增特异引物及PCR扩增:(I)偃麦草属Ee基因组PCR扩增特异引物的序列:PERl:CTACCTCCGTCCAGAAATAACT,PEFl:CTCCCTCCCTCCAGAAATAACT ；(2 )使用上述特异引物进行PCR扩增:PCR 反应体系 50yL，含 IOXExTaq buffer, MgCl22mmol/L, dNTP200 μ mol/L，引物0.4 μ mol/L, ExTaq酶1.5U，IOOng待测偃麦草属植物的DNA为模板，加重蒸水至终体积为50 μ L ；(3) PCR 扩增程序:94°C预变性 4min ;94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 个循环；72°C保温 IOmin ；S3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测及鉴定。本专利技术中CTAB 缓冲液组成是 100mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmol/L EDTA ρΗ8.0，IOOmmoI/L NaCl，质量浓度为2%CTAB，用前加质量浓度为2%β -巯基乙醇。本专利技术是以待测偃麦草属植物的基因组DNA为模板，用Ee基因组PCR扩增特异引物进行PCR扩增，用质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，凝胶成像系统观察照相记录。如果经电泳检测得到IlObp的PCR扩增产物条带，则待测偃麦草属植物具有E6基因组。本专利技术的优点和有益效果如下:本专利技术开发设计了一种新的特异引物，能够扩增出偃麦草属Ee基因组密切相关的关键条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强，可作为偃麦草属Ee基因组鉴定的特异引物。本专利技术引物的应用，具有准确性高、结果稳定、不受环境条件和植物发育时期等影响的特点，可以快速、准确地鉴定多倍体偃麦草属植物是否具有Ee基因组。本专利技术可用于以偃麦草属植物为亲本的远缘杂交后代的快速室内鉴定，在早期就可以通过PCR方法对材料进行鉴定，加强偃麦草属植物的育种利用，有利于提高偃麦草属植物的外源遗传物质导入小麦后的检测，确定导入的外源片段和优质基因等，辅助育种中附加系、代换系、易位系等中间材料及其衍生后代的选育。本专利技术解决了以往基因组原位杂交技术、特异序列的荧光原 位杂交、全基因组Southern杂交鉴定基因组方法的操作繁锁、人为因素影响大、费用高以及基因组特异RAro片段鉴定基因组的方法易受基因组重复序列影响，稳定性不高等问题，具有操作简单、扩增产物单一、重复性高、模板DNA用量少、经济快捷等优点。【附图说明】 图1是PCR扩增结果凝胶电泳图；图中M——500bp DNA分子量标准，I——二倍体长穗偃麦草，2—二倍体比萨偃麦草，3—四倍体丛生偃麦，4—四倍体球茎偃麦。【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术做进一步的详细描述，但并非对本专利技术的限制，凡依照本专利技术公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本专利技术的保护范围。实施例1本实施例的实验材料为二倍体长穗偃麦草、二倍体比萨偃麦草、四倍体丛生偃麦和四倍体球茎偃麦。本实施例中快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法，包括以下步骤:S1、待测偃麦草属植物的基因组DNA提取:(I)分别取待测二倍体长穗偃麦草、二倍体比萨偃麦草、四倍体丛生偃麦和四倍体球茎偃麦幼嫩叶片3-5g，于液氮中研磨至粉末状，分别放入50mL离心管中；(2)向每个50mL离心管中加入15mL预热至65°C的2XCTAB缓冲液，轻摇混匀，65°C水浴保温30min，其间轻轻摇匀几次；(3)向每个50mL离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，V:V)，摇匀至上清液呈乳白色，4°C, 10, OOOg离心IOmin,取上清；(4)重复以上步骤，至分界面澄清；(5)向上述每份澄清液中加入等体积预冷异丙醇，摇匀，放入-20°C冰箱沉淀30min 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、待测偃麦草属植物基因组DNA提取：（1）取待测偃麦草属植物幼嫩叶片3?5g，于液氮中研磨至粉末状，放入50mL离心管中；（2）加入15mL预热至65℃的2×CTAB缓冲液，轻摇混匀，65℃水浴保温30min，其间轻轻摇匀几次；（3）加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24：1，摇匀至上清液呈乳白色，4℃、10,000g离心10min，取上清；（4）重复以上步骤，至分界面澄清；（5）加入等体积预冷异丙醇，摇匀，放入?20℃冰箱沉淀30min；（6）勾出DNA沉淀，用70%酒精洗2?3次，无水乙醇洗1?2次；（7）风干后，将DNA溶于TE溶液，置于?20℃冰箱中备用。S2、设计PCR扩增特异引物及PCR扩增：（1）偃麦草属Ee基因组PCR扩增特异引物的序列：PER1:CTACCTCCGTCCAGAAATAACT，PEF1:CTCCCTCCCTCCAGAAATAACT；（2）使用上述特异引物进行PCR扩增：PCR反应体系50μL，含10×ExTaq?buffer，MgCl22mmol/L,dNTP200μmol/L，引物0.4μmol/L，ExTaq酶1.5U，100ng待测偃麦草属植物的DNA为模板，加重蒸水至终体积为50μL；（3）PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃保温10min；S3、将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测及鉴定，如果经电泳检测得到110bp的PCR扩增产物条带，则所述待测偃麦草属植物具有Ee基因组。...

【技术特征摘要】
1.一种快速有效鉴定偃麦草属Ee基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51、待测偃麦草属植物基因组DNA提取: (1)取待测偃麦草属植物幼嫩叶片3-5g，于液氮中研磨至粉末状，放入50mL离心管中； (2)加入15mL预热至65°C的2XCTAB缓冲液，轻摇混匀，65°C水浴保温30min，其间轻轻摇匀几次； (3)加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶剂，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，摇匀至上清液呈乳白色，4°C、10，OOOg离心lOmin，取上清； (4)重复以上步骤，至分界面澄清； (5)加入等体积预冷异丙醇，摇匀，放入_20°C冰箱沉淀30min； (6)勾出DNA沉淀，用70%酒精洗2-3次，无水乙醇洗1_2次； (7)风干后，将DNA溶于TE溶液，置于_20°C冰箱中备用。 52、设计PCR扩增特异引物及PCR扩增: (1)偃麦草属Ee基因组PCR扩增特异引物的序列:PERl:CTACCTCCGTCCAGAAATAACT,PEFl:CTCCCTCCCTCCAGAAATAACT ； (2)使用上述特异引物进行PCR扩增: P...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永红，沙莉娜，凡星，张海琴，康厚扬，王益，崔忠刚，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：