本发明专利技术公开了一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。该高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列；2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。本发明专利技术的RNA和编码该RNA的RNAi载体，可用来增强植物对TuMV或草铵膦除草剂的抗性，同时也为高抗TuMV转基因植物的培育奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
—种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体
本专利技术属于植物抗病毒基因工程领域，具体涉及一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
技术介绍
完菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)属马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyviruse)。TuMV寄主范围十分广泛，能够侵染43科156属318种植物。TuMV是危害十字花科作物最为严重的病毒。感染病毒后的作物还容易感染霜霉病和软腐病，造成复合侵染，直接影响到产量和商品价值。油菜是我国主要的油料作物，芜菁花叶病毒病是油菜的重要病害之一。在我国长江中下游，油菜因病毒病减产一般达20-30%，大流行年达50%左右。感病油菜不仅产量降低，而且产油率和种子萌芽率也明显降低。另据调查我国白菜因TuMV危害平均每年造成5-10%的产量损失，病害严重的地块几乎绝收。TuMV主要是靠蚜 虫以非持久性的方式传播，至少有89种蚜虫可传播该病毒。而采用杀虫剂不可能很快杀死全部的蚜虫以阻止病毒的传播，仅靠杀虫剂杀蚜防治病毒病的效果不明显，还易造成环境污染。因此寻求新的抗病方法成为了一项迫切的任务。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。本专利技术提供的一种RNA,具有下述核苷酸序列之一:I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的核苷酸序列；2)与I)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。所述具有相同功能具体指具有下述任一功能:I)增强植物对TuMV的抗性；2)增强植物对除草剂的抗性。所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。所述TuMV 具体为 TuMV-C4 和 / 或 BJ-ROI。所述除草剂具体为草铵膦除草剂。所述RNA的编 码基因也属于本专利技术的保护范围。含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-360位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。具体的，所述出发载体为pBBBast。所述的重组表达载体中，所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQ IDNa.3所述的第1371-2873位核酸序列。所述重组表达载体的制备过程具体为:将具有序列表中SEQ ID Na.3所述的核酸序列的双链DNA分子插入植物表达双元载体pBBBast的XmaI单酶切位点，即得重组表达载体 pBBBTu-VPg。所述插入前，还需在所述pBBBast的XmaI单酶切位点的两个粘性末端各补两个碱基C。所述植物表达双元载体pBBBast为将具有序列表中SEQ ID Ns.4所示核酸序列的双链DNA分子插入载体pBBRlMCS-2的SspI酶切位点得到的重组质粒。本专利技术的另一个目的是提供所述RNA、所述RNA的编码基因、所述含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用:I)制备抗TuMV的产品；2)增强植物对T uMV的抗性；3)增强植物对草铵膦除草剂的抗性。所述应用中，所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。[0031 ] 所述应用中，所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-ROI。所述应用中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。本专利技术的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述的任一重组表达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强；2)对除草剂的抗性增强。所述对TuMV的抗性增强是通过抑制TuMV复制实现的。所述方法中，所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-ROl。所述方法中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。所述方法中，所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。【附图说明】图1为中间载体的酶切验证结果，其中M为分子量标记；泳道I为pHannibal-VPg载体的酶切结果；泳道2为连入反向片段pHannibal-VPg(-)载体的酶切结果；泳道3为pHannibal空载体的酶切结果。图2为载体pBBBTu-VPg的结构示意图。图3为植物表达载体pBBBTu-VPg的MluI酶切检测结果图，其中M为分子量标记；泳道I为pBBBTu-VPg载体的酶切结果。图4为T1代苗喷洒草铵膦除草剂后结果，存活的为除草剂抗性株。图5为部分转基因T1代苗PCR鉴定结果图，其中泳道M为分子量标记；泳道I为对照col-0的结果；泳道2-8为除草剂筛选出的转基因T1代苗的结果 。图6为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。图7为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后种子收获时的图片，其中col代表野生型col-0的结果。图8为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后的病情指数统计结果，其中col代表野生型col-0的结果，#01, #04’ #12, #14’ #15, #18, #42分别代表7个转基因高抗株系的结果。图9为转基因高抗株系#04和#42接种BJ-ROl后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。图10为TUMV-C4接种拟南芥后，RT-PCR检测TuMV外壳蛋白基因在转基因拟南芥中的表达，其中图a为TuMV-CP片段的扩增结果图，图a中泳道I为阴性对照结果，泳道M为分子量标记，泳道2为对照Col-O的结果，泳道3-9依次为转基因高抗株系#01’ #04, #12, #14, #15, #18, #42的结果；图b为内参Sand基因的扩增结果图，图b中泳道M为分子量标记，泳道I为阴性对照结果，泳道2为对照Col-O的结果，泳道3-9依次为转基因高抗株系 #01, #04, #12, #14, #15, #18, #42 的结果。图11为TUMV-C4接种拟南芥后，荧光定量PCR分析结果，其中col代表野生型col-0的结果，#01, #04’ #12, #14’ #15, #18, #42分别代7个转基因高抗株系的结果。【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、材料本实验所用野生型拟南芥Col-O 购自 Arabidopsis Biological ResourceCenter0北京地区芜菁花叶病毒TuMV主要的流行强致病株系TUMV-C4获自中国农业科学院蔬菜花卉所；参考文献:冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生，北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定，中国蔬菜，1988,4:11-13 ;公众可从北京农业生物技术研究中心获得该株系OTu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RNA，具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID?№.2所示的核苷酸序列；2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
【技术特征摘要】
1.一种RNA,具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的核苷酸序列； 2)与1)限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。2.权利要求1所述的RNA的编码基因。3.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-360位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQ ID Na.3所述的第1371-2873位核酸序列。6.根据权利要求3-5任一所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体的制备过程具体为...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚磊，叶艳英，曾钢，曹鸣庆，马荣才，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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