本发明专利技术属环境毒理学领域，涉及一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法。它以斑马鱼为测试生物，将其暴露于典型抗生素废水中，通过分析典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性、亚急性毒性，定量地测定典型抗生素废水对斑马鱼的短期或长期毒性效应，急性毒性以96小时半数致死浓度（96h?LC50）（典型抗生素废水体积百分比%）描述，亚急性毒性以鱼体生化指标，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量等描述。采用该方法可以对典型抗生素废水的毒性特征和毒性水平进行分析测试和定量描述，解决常规理化指标不能反映的典型抗生素废水生物毒性，同时可作为典型抗生素废水生物毒性监测和评价的指标。
【技术实现步骤摘要】
—种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法
本专利技术属于环境毒理学领域，涉及。
技术介绍
抗生素废水是一类色度高、含难降解和生物毒性物质多的高浓度有机废水。2010年7月国家环保部颁布了《制药工业水污染物排放标准》，其中规定了以抗生素等为主的发酵类制药工业企业水污染物的排放限值、监测和监控要求。涉及毒性的排放指标只有急性毒性指标(HgCl2毒性当量)，测试方法为发光细菌法，该指标仅能反映抗生素废水是否对发光菌有毒性，但发光菌为低等生物，其结果不能代表抗生素废水对高等生物的影响，为此需要寻找新的方法和指标来评价抗生素废水的生物毒性。
技术实现思路
本专利技术为解决现在抗生素废水生物毒性定性和定量评估的问题，提供了一种采用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法。该方法采用急性毒性、亚急性毒性测试，定性和定量两种指标描述典型抗生素废水的生物毒性，弥补抗生素废水生物毒性监测指标的不足。本专利技术的思路是，采用短期(96小时)暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性，以96h LC50 (典型抗生素废水的体积百分比％)描述，采用长期(20天)暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示。判断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为:急性毒性测定得到96hLC5tl (典型抗生素废水的体积百分比％);亚急性毒性为典型抗生素废水对斑马鱼鱼体抗氧化指标的影响是否显著。如果暴露组与空白对照组差异显著:认为典型抗生素废水有亚急性生物毒性。暴露组与空白对照组差异不显著:认为典型抗生素废水无亚急性生物毒性。依据上述判据评估典型抗生素废水对斑马鱼的毒性类型以及毒性水平，从而可以确定典型抗生素废水的毒性类型(属于急性毒性还是亚急性毒性)和毒性水平(毒性的显著性水平)。本专利技术采用以下技术方案予以实现:—种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，该方法采用斑马鱼体内试验方法，分别利用短期(96小时)和长期(20天)暴露方式描述典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性和亚急性毒性，判断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为:急性毒性以96hLC50 (典型抗生素废水体积百分比％)描述；亚急性毒性以一组抗氧化指标描述；利用短期(96小时)暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性，急性毒性测定得到96h LC50 (典型抗生素废水体积百分比％);以96h LC5tl描述急性毒性；利用长期(20天)暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示，然后利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t < ta(l5(n)，即P > 0.05时，认为无显著性差异；当 t0.05 (n) ≤ t〈 to o! (n)， 即0.01 < P≤0.05时，认为差异显著；当t >t。.01 (η)，即P ≤ 0.01时，认为差异极显著；本测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著(0.01<P<0.05或者Ρ〈0.01)，则认为典型抗生素废水有亚急性生物毒性，若暴露组与空白对照组差异不显著，则认为典型抗生素废水无亚急性生物毒性。所述的利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，它包括以下具体步骤:(I)准备测试生物，选用斑马鱼(Zebra Fish)为受试生物，雌雄个体各半，斑马鱼经5%食盐水消毒后，用曝气48h的脱氯自来水在实验室驯养7天，在预实验前一天和试验期间不予喂食，避免鱼饵对测试结果产生影响；(2)准备测试条件，试验溶液pH值为7.0?8.5 ;总硬度为240?250mg/L (以CaCO3计)，试验温度为23?25°C ;溶解氧高于5mg/L ;采用自然光照；试验周期为96h (预实验和急性毒性实验持续时间)或20d (亚急性毒性实验持续时间);试验方式为静水式(每24h更换一次试液)，每天至少测定I次试验溶液的水温、硬度、pH值、溶解氧含量；(3)进行预实验，在50cmX20cmX25cm的玻璃水族缸中，盛放20L试验溶液，分为5?6个暴露组，暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。三种典型抗生素废水暴露组分别设置如下:青霉素废水暴露浓度组为5%、10%、15%、20%、25%和30% ；土霉素废水暴露浓度组为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6% ;链霉素废水暴露浓度组为1%、3.2%、10%、32%、100% ;不设平行组，每个暴露组放5尾斑马鱼，连续实验96h，每日至少两次记录各容器内的死鱼数并及时取出死鱼；计算得出预实验结果:最低的24h绝对致死浓度(典型抗生素废水的体积百分比％)和最高的96h无死亡浓度(典型抗生素废水的体积百分比％)。青霉素废水预实验结果:最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死亡浓度分别为20% (青霉素废水的体积百分比％)和10% (青霉素废水的体积百分比％)。土霉素废水预实验结果:最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死亡浓度分别为0.1% (土霉素废水的体积百分比％)和0.5% (土霉素废水的体积百分比％)。链霉素废水预实验结果:最低的24h绝对致死浓度和最高的96h无死亡浓度分别为100% (链霉素废水的体积百分比％)和10% (链霉素废水的体积百分比％)。(4)急性毒性测试方法根据所述步骤(3)的测试结果，在24h绝对致死浓度(典型抗生素废水的体积百分比％)和最高的96h无死亡浓度(典型抗生素废水的体积百分比％)之间按等对数间距设置5个暴露组，暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。三种典型抗生素废水暴露组分别设置如下:青霉素废水暴露浓度组为10%、12.57%、15.81%、19.88%、24.99% ; 土霉素废水暴露浓度组为 0.1%、0.15%、0.22%、0.33%、0.5% ;链霉素废水暴露浓度组为17.78%,23.71%,31.62%,42.17%,56.23%。每个暴露组设2个平行组，并设置空白对照组，共计11个组，每个暴露组随机放入8尾斑马鱼，试验周期为96h，试验结果以半数致死浓度(典型抗生素废水的体积百分比％)表示，每隔24h更换I次试验溶液，采用寇式法和概率单位法两种方法计算得出96h LC5tl(典型抗生素废水的体积百分比％)及其95%的置信限。急性毒性测试结果为:青霉素废水96h LC50为13.46% (寇式法)和13.66% (概率单位法);土霉素废水96h LC50为0.22% (寇式法)和0.19% (概率单位法);链霉素废水96hLC50为25.56% (寇式法)和29.51% (概率单位法)。(5)亚急性毒性测试方法参照步骤(4)的测试结果设置亚急性的暴露组，暴露组浓度在1/6 96h LC5tl和1/2 96h LC5tl之间，设置5个暴露组，青霉素废水、土霉素和链霉素暴露浓度组均为 1/256 96h LC50U/64 96hLC50、l/16 96h LC50U/4 96h LC50,1/2 96h LC500暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。每个暴露组设置2个平行组，I个空白对照组，共计16个组。暴露时间为20天，选取健康的斑马鱼，雌雄个体各半，每个组15尾斑马鱼，每天换水。5个暴露组分别于第4、8、12、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，其特征是，该方法采用斑马鱼体内试验方法，分别利用短期即96小时和长期即20天的暴露方式描述典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性和亚急性毒性，判断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为：急性毒性以96h?LC50描述；亚急性毒性以一组抗氧化指标描述；利用短期暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性，急性毒性测定得到96h?LC50；以96h?LC50描述急性毒性；利用长期暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示，然后利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t＜t0.05(n)，即P＞0.05时，认为无显著性差异；当t0.05(n)≤t＜t0.01(n)，即0.01＜P≤0.05时，认为差异显著；当t＞t0.01(n)，即P≤0.01时，认为差异极显著；本测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著，即0.01
【技术特征摘要】
1.一种利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，其特征是， 该方法采用斑马鱼体内试验方法，分别利用短期即96小时和长期即20天的暴露方式描述典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性和亚急性毒性，判断典型抗生素废水对斑马鱼是否具有毒性的判据为:急性毒性以96h LC50描述；亚急性毒性以一组抗氧化指标描述； 利用短期暴露方式，测定得到典型抗生素废水对斑马鱼的急性毒性，急性毒性测定得到96h LC50 ；以96h LC50描述急性毒性； 利用长期暴露方式，亚急性毒性以鱼体的一组抗氧化指标表示，然后利用显著性t检验，检验暴露组与空白对照组间的差异，当t < ta(l5(n)，即P > 0.05时，认为无显著性差异；当 ^0.05 (n) ^ t〈 ^0.01 (η) ? 即0.01 < P≤0.05时，认为差异显著；当t >t0.01 (η)，艮P P € 0.01时，认为差异极显著； 本测试方法为，如果暴露组与空白对照组差异显著，即0.01<Ρ<0.05或者Ρ〈0.01时，则认为典型抗生素废水有亚急性生物毒性，若暴露组与空白对照组差异不显著，则认为典型抗生素废水无亚急性生物毒性。2.如权利要求1所述的利用斑马鱼测试典型抗生素废水毒性的方法，其特征是，它包括以下具体步骤: (1)准备测试生物，选用斑马鱼为受试生物，雌雄个体各半，斑马鱼经5%食盐水消毒后，用曝气48h的脱氯自来水在实验室驯养7天，在预实验前一天和试验期间不予喂食，避免鱼饵对测试结果产生影响； (2)准备测试条件，试验溶液pH值为7.0~8.5 ;总硬度以CaCO3计为240~250mg/L，试验温度为23~25°C ;溶解氧高于5mg/L ;采用自然光照；试验周期为96h或20d ;试验方式为静水式，即每24h更换一次试液，每天至少测定I次试验溶液的水温、硬度、pH值、溶解氧含量； (3)进行预实验，在50cmX20cmX25cm的玻璃水族缸中，盛放20L试验溶液，分为5~.6个暴露组，暴露组浓度以试验溶液中含典型抗生素废水的体积百分比表示。三种典型抗生素废水暴露组分别设置如下:青霉素废水暴露浓度组为5%、10%、15%、20%、25%和30% ;土霉素废水暴露浓度组为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6% ;链霉素废水暴露浓度组为1%、.3.2%、10%、32%、100% ;不设平行组，每个暴露组放5尾斑马鱼，连续实验96h，每日至少两次记录各容器内的死鱼数并及时取出死鱼；计算得出预实验结果:最低的24h...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈洪艳，杨雷，武晨虹，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：
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