高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法和用于该方法的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种不必进行繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。胆固醇的定量方法包括：使磷脂酶与HDL发生作用，来定量胆固醇。该方法包括：步骤一，使受检样品中的高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2胆固醇，通过利用该方法进行步骤二，可以定量受检样品中的高密度脂蛋白2胆固醇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法和用于该方法的试剂盒
本专利技术涉及高密度脂蛋白2(以下，有时称作“HDL2”)中的胆固醇(以下，有时将HDL2中的胆固醇称作“HDL2胆固醇”)的定量方法和用于该方法的试剂盒。
技术介绍
由于高密度脂蛋白(HDL)从包含动脉硬化壁的各组织接受胆固醇，所以其与蓄积在细胞内的胆固醇的除去作用有关，因此其还被称作胆固醇逆转运系统。已知HDL与冠状动脉硬化等动脉硬化疾病呈负相关，已知HDL呈低值，这作为脂质异常症之一而设有低值限，可以作为动脉硬化的指标。HDL由脱辅基蛋白、磷脂、胆固醇和中性脂肪构成。HDL的密度d＝1.063～1.210g/mL，进一步被分类为下述的两种组分(分画)：d＝1.063～1.125g/mL的HDL2和d＝1.125～1.210g/mL的HDL3。根据脂蛋白的分布曲线，在d＝1.125g/mL部分确认到凹口，从这里起将密度重的部分作为HDL3。另外，还存在着下述的亚组分(亜分画)的划分方法，即在HDL中的脱辅基蛋白中，根据脱辅基脂蛋白E含量差，将脱辅基脂蛋白E的含量多的HDL作为富含脱辅基脂蛋白E的HDL。一直以来，已知不仅HDL全体、就连HDL2和HDL3各亚组分也显示出不同的作用。据说HDL2具有抗动脉硬化作用。已知在临床上，由于CETP缺损，HDL没有代谢成LDL或IDL，HDL胆固醇量增加。据说由于CETP缺损而增加的HDL是HDL2。另外，据说由于CETP缺损，富含脱辅基脂蛋白E的HDL上升，据说富含脱辅基脂蛋白E的HDL，其争夺胆固醇的能力强，具有抗血小板作用，即使在HDL中也是较好的。另外，由于肝性脂肪酶活性降低，HDL3没有转变成HDL2，HDL3增加。即，HDL的各亚组分的比率根据病态而不同，仅凭只测定HDL，难以看到它们的变化。根据上述的倾向测定HDL的各亚组分，预想这将有助于判断动脉硬化疾病或脂质异常症等疾病的有无或病因。目前，各制造商正在推进依据这些HDL亚组分的作用、抑制CETP的作用、减少LDL胆固醇量、增加HDL胆固醇量的治疗药的开发。确立HDL亚组分的简便的测定方法，这有可能关系到详细的作用的阐明或它们的治疗效果。迄今为止，作为HDL亚组分的测定方法而已知的方法，有超离心法、高效液相色谱(HPLC)法、HDL3沉淀法(专利文献1)、NMR法等。超离心是指利用脂蛋白的密度差，通过离心进行分馏的方法，存在着操作必需熟练、需要数日、费用也高的缺点。在冈崎等人采用HPLC来区分HDL2和HDL3的方法中，操作需要时间，还需要特别的仪器。HDL3沉淀法是指，利用包含二价金属离子和葡聚糖硫酸的试剂，使HDL3以外的脂蛋白聚集，通过离心回收上清部分的HDL3，再利用自动分析装置进行测定的方法。该方法仍然要求操作熟练，而且是手动的方法，有时还需要进行检体的前处理操作，存在着到测定为止需要花费某种程度的时间的缺点，不具有通用性。另外，NMR法是通过核磁共振来计测脂蛋白的颗粒数的方法，其需要特殊的机械，通常不采用。需要说明的是，存在HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。虽然可以利用通用自动分析装置进行测定，但采用通过使用表面活性剂由于酶的作用抑制HDL3以外的脂蛋白的方法，通过测定HDL3并根据总HDL求出HDL3值的差，可以测定HDL2，但该方法不是可以直接测定HDL2的方法。必需专利技术简便且可以更具选择性地定量HDL2中胆固醇量的试剂，以代替上述的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2009-207463号公报；专利文献2：日本特开2001-346598号公报。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供：不需要繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于提供：不需要繁杂的操作，即可定量受检样品中的HDL2胆固醇的方法。另外，本专利技术的目的还在于提供：用于利用本专利技术的方法来定量HDL2的试剂盒。解决课题的方法本申请的专利技术人深入研究的结果，发现了磷脂酶与HDL中的HDL2作用、而几乎不与HDL3作用的条件，找到了通过利用磷脂酶可以优先测定HDL2的方法，实验性地确认了这可以实现，完成了本专利技术。即，本专利技术提供HDL2的胆固醇的定量方法，该方法包括：使磷脂酶与HDL作用，来定量胆固醇。另外，本专利技术还提供用于通过上述本专利技术的方法定量高密度脂蛋白2中的胆固醇的试剂盒，该试剂盒包含磷脂酶。而且，本专利技术还提供受检样品中的高密度脂蛋白2胆固醇的定量方法，该方法包括下述步骤：步骤一，使受检样品中的高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2胆固醇，其中，利用上述本专利技术的方法进行该步骤二。专利技术效果根据本专利技术，无需超离心或前处理等繁杂的操作，可以使用自动分析装置特异性地定量受检样品中的HDL2胆固醇。另外，通过由利用作为现有技术的受检体中HDL总胆固醇定量法得到的总HDL胆固醇量算出HDL2胆固醇量的差，还可以定量HDL3胆固醇量。具体实施方式如上所述，本专利技术的HDL2胆固醇的定量方法包括：使磷脂酶与HDL作用，来定量胆固醇。通过将该定量方法应用于从自生物体内分离的受检样品中预先除去HDL以外的脂蛋白中的胆固醇而得到的样品，可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。即，受检样品中的HDL2胆固醇的定量方法包括：步骤一，使受检样品中的HDL以外的胆固醇转移到反应系统外；以及步骤二，定量反应系统内残留的HDL中的HDL2胆固醇，其中，作为该定量方法中的步骤二，通过采用上述本专利技术的方法，可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。以下，对该两步骤法进行说明。需要说明的是，在以下的说明中，虽然说明两步骤法，但该两步骤法的步骤二是本专利技术的方法(不过，该两步骤法本身也是本专利技术的方法)。另外，为了进行本专利技术的方法，以下的步骤一不是必须的，通过利用其他公知的方法、例如超离心法等从自生物体内分离的受检样品中只取出HDL，再应用本专利技术的方法(下述步骤二)，也可以定量受检样品中的HDL2胆固醇。不过，在这种情况下，必需重新供给胆固醇的定量所必需的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶(在以下的两步骤法中，步骤一中使用的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶可以继续在步骤二中使用)。作为供给本专利技术的方法的受检样品，只要是想要定量其样品中的HDL2胆固醇的样品即可，没有特别限定，但优选为血清或血浆或它们的稀释物，特别优选血清或其稀释物。本专利技术中想要测定的HDL2，是指相当于密度d＝1.063～1.125g/mL或粒径为12.1～16nm的部分等在HDL中也属于较大颗粒的HDL。但是，上述定义是指HDL的在连续范围内的界定，未必是根据上述数值明确地限定临床意义。在一般的报告中，也存在着密度的界定不同的HDL，所以大致将上述范围的大颗粒侧的HDL作为HDL2。需要说明的是，当为大颗粒侧的HDL时，富含脱辅基脂蛋白E的HDL等也包含在本专利技术的测定范围内。在本专利技术的步骤一中，除了向受检样品中添加胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶等胆固醇反应酶，还添加磷脂酶或脂蛋白脂肪酶，使之反应。磷脂酶、脂蛋白脂肪酶可以添加1种也可以是两种以上组合添加。而且，在步骤一中还可以使用表面活性剂，还可以将前述的酶和表面活性剂组合使用。在本本文档来自技高网...

【技术保护点】
高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法，该方法包括：使磷脂酶与高密度脂蛋白作用，来定量胆固醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.28 JP 2011-0423741.高密度脂蛋白2中的胆固醇的定量方法，该方法包括下述的步骤一和步骤二：步骤一：使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶、以及磷脂酶或脂蛋白脂肪酶与受检样品作用，以使高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外；或者使胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶、以及磷脂酶或脂蛋白脂肪酶与受检样品作用，以使高密度脂蛋白以外的胆固醇转移到反应系统外，步骤二：使磷脂酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：樋口麻衣子，伊藤康树，
申请(专利权)人：电化生研株式会社，
类型：
国别省市：