包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物制造技术

技术编号:9600421 阅读:159 留言:0更新日期:2014-01-23 04:56
本发明专利技术涉及含有置换半胱氨酸的人胰岛素类似物、含有聚乙二醇化的置换半胱氨酸的人胰岛素衍生物和制备它们的方法。本发明专利技术的化合物可用于治疗糖尿病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物
本专利技术涉及新颖的人胰岛素类似物和衍生物。本专利技术也涉及制备它们的方法。序列表的通过引用并入标题为“SEQUENCELISTING(序列表)”的序列表是6.317字节,创建于2011年3月1日,且通过引用并入本文。
技术介绍
糖尿病是代谢障碍,其中利用葡萄糖的能力部分地或完全地丧失。目前,糖尿病(I型糖尿病和II型糖尿病两者)的治疗以越来越大的程度依赖于胰岛素治疗。在过去的十年中,已经为特定作用模式(即速效或长效)设计了许多人胰岛素类似物。例如,胰岛素Detemir®是一种用于维持胰岛素的基础水平的长效人胰岛素类似物。与位置B29处的赖氨酸共价结合的脂肪酸(豆蔻酸)的存在延迟胰岛素的作用。尽管最近在市场上可得到胰岛素类似物的改进,仍然持续需要扩大和多样化现有的胰岛素类似物集合,所述胰岛素类似物表现出不同的药理学性能,诸如稳定性和作用模式,同时维持有效的胰岛素活性,以便满足患者的各种具体需要。赖氨酸残基已经被用作化学化合物在胰岛素分子上的连接位点。但是,使用赖氨酸作为锚定点来制备胰岛素衍生物的方法存在限制,且不容易操作。实际上,赖氨酸不允许在胰岛素分子上进行位点特异性的连接,因为胰岛素分子还包含2个在类似条件下与赖氨酸的ε-氨基反应的N-端α-氨基。与其它化学基团的反应可能产生连接在胰岛素上的不同位点处的一种或多种这类化学基团的异质混合物。另外,当在胰岛素的加工中使用水解无色杆菌(A.lyticus)蛋白酶(ALP)(其在赖氨酸残基后面切割)时,在胰岛素分子中不可能存在内部赖氨酸。因此,化学基团的连接位点限于A-链和/或B-链的C端末端中的赖氨酸残基。已经提议使用半胱氨酸作为锚定点。Kuo等人在专利文献WO2010/033220(其涉及意图用于肺给药的治疗性肽)中提示,用半胱氨酸残基替换胰岛素B-链的首4个氨基酸中的任一个,然后使这样的半胱氨酸残基与活化的聚乙二醇(PEG)反应,所述活化的聚乙二醇对与巯基(例如,N-马来酰亚胺基聚合物)的反应是特异性的。但是,已知的是,半胱氨酸残基向胰岛素中的添加通常会使该分子失稳,并且Kuo等人没有公开制备这样的肽的方法,也没有证实这样的化合物的可行性和有效性。因此,仍然需要新的胰岛素类似物和衍生物、在胰岛素分子上的新锚定位点、和它们的改进的制备方法。
技术实现思路
本专利技术涉及新胰岛素类似物和新胰岛素衍生物。本专利技术基于下述认识:在位置A10C、A14C、A15C、A18C、A19C、A21C、B25C和B27C之一处向胰岛素分子中引入额外半胱氨酸,会提供实现化学选择性反应的新化学锚定点。令人惊奇地,已经发现,本专利技术的胰岛素类似物在宿主细胞中具有良好的表达率,所述额外半胱氨酸不会造成对胰岛素中的现有二硫键的干扰,并且携带与所述额外半胱氨酸连接的化学化合物的胰岛素衍生物表现出对胰岛素受体的高结合亲和力和有效的生物活性。实际上,这是重要的,因为本专利技术的专利技术人已经令人惊讶地发现,可以制备一些半胱氨酸置换的类似物,并且这些半胱氨酸置换的类似物中的一些可以有效地或容易地用于连接聚合物。本专利技术的专利技术人已经面对和克服了一些远远超过常规实验的困难。在一个方面,本专利技术涉及人胰岛素类似物,其包含具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或desB30人胰岛素:A10C、A14C、A15C、A18C、A19C、A21C、B25C、B27C。在另一个方面,本专利技术涉及人胰岛素衍生物,其包含如本文中定义的人胰岛素类似物,其中所述置换半胱氨酸与甲基聚乙二醇马来酰亚胺分子(MM(PEG))或与N-乙基马来酰亚胺分子(NEM)共价连接。在一个方面,本专利技术的新颖的胰岛素化合物提供目前可得到的胰岛素化合物的有效替代物。另外或可替换地,本专利技术的新颖的胰岛素化合物可以容易地或有效地制备。另外或可替换地,本专利技术的新颖的胰岛素化合物表现出对胰岛素受体的有效结合亲和力。另外或可替换地,本专利技术的新颖的胰岛素化合物可以用于治疗糖尿病患者。另外或可替换地,本专利技术的新颖的胰岛素化合物表现出与人胰岛素相比增强的稳定性和/或延长的体内半衰期。另外或可替换地,本专利技术的新颖的胰岛素化合物可以通过皮下途径来施用。在另一个方面,本专利技术涉及如本文中定义的人胰岛素类似物作为用于制备药物的起始原料或中间体化合物的用途。另外或可替换地,本专利技术涉及如本文中定义的人胰岛素类似物作为用于制备胰岛素化合物或人胰岛素衍生物的起始原料或中间体化合物的用途、或在制备胰岛素化合物或人胰岛素衍生物的方法中的用途。本专利技术的胰岛素类似物也为其它化学化合物的结合和新颖的胰岛素衍生物的生成提供了位点特异性的连接反应。在另一个方面,本专利技术涉及用于制备这样的人胰岛素类似物和衍生物的方法。在一个方面,本专利技术的方法比现有技术的那些方法简化和/或更容易操作。另外或可替换地,它们是化学选择性的。另外或可替换地,它们不需要胰岛素分子的保护步骤。在另一个方面,本专利技术涉及用作药物的如本文中定义的人胰岛素类似物和衍生物。另外或可替换地,本专利技术涉及用于治疗糖尿病的如本文中定义的人胰岛素类似物和衍生物。在另一个方面,本专利技术涉及核酸序列,其编码如本文中定义的人胰岛素类似物或其前体。在另一个方面,本专利技术涉及宿主细胞,其包含含有如本文中定义的核酸序列的表达载体。附图说明图1显示了携带置换Cys的不同胰岛素类似物的表达收率。图1a涉及具有在A-链中的置换Cys的类似物,图1b涉及具有在B-链中的置换Cys的类似物。图2显示了不同胰岛素类似物的修饰前体相对于表达的类似物前体的总量的比例。图3显示了在用MM(PEG)12烷基化A21CdesB30之前(图3a)和之后(图3b),A21CdesB30类似物和衍生物的群体。图4显示了在胰岛素类似物或人胰岛素静脉内注射以后,大鼠的血糖水平的下降。具体实施方式在本专利技术中,提供了新颖的胰岛素类似物和衍生物。对随后的化学选择性反应而言,所述新颖的类似物提供了新化学锚定点。本专利技术的新颖的胰岛素类似物和衍生物可以用于治疗糖尿病。在一个方面,本专利技术涉及具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或desB30人胰岛素:A10C、A14C、A15C、A18C、A19C、A21C、B25C、B27C。本文中使用的术语“人胰岛素”是指众所周知其序列、结构和性质的人胰岛素激素。人胰岛素具有2个被命名为A-链和B-链的多肽链。A-链是21氨基酸肽,B-链是30氨基酸肽,2个链通过二硫键连接:第一个二硫键在A-链的位置7处的半胱氨酸和B-链的位置7处的半胱氨酸之间,第二个二硫键在A-链的位置20处的半胱氨酸和B-链的位置19处的半胱氨酸之间。第三个二硫键存在于在A-链的位置6和11处的半胱氨酸之间。本文中使用的术语“desB30人胰岛素”是指人胰岛素的类似物,其中B30氨基酸缺失。desB30人胰岛素的序列是众所周知的。编码人胰岛素和desB30人胰岛素的核酸序列也是众所周知的。以阐明链(A或B)、位置、和置换天然氨基酸残基的氨基酸残基的单字母或三字母代码的方式表示胰岛素分子中的修饰。在本文中,诸如“A1”、“A2”和“A3”等术语表示,从人胰岛素的N-端末端计起,分别在胰岛素A链中的位置1、2和3等处的氨基酸。类似地,诸如B1、B2和B3等术本文档来自技高网
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包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物

【技术保护点】
一种人胰岛素类似物,其包含具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或desB30人胰岛素:A10C、A14C、A15C、A18C、A19C、A21C、B25C、B27C。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.15 EP 11158315.9;2011.03.23 US 61/4665781.一种人胰岛素类似物,其是具有选自下述的一个半胱氨酸置换的人胰岛素或desB30人胰岛素:A21C,其中A21C指从A链的N-端末端计起,胰岛素A链的第21位氨基酸被半胱氨酸置换。2.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物,其是A21C人胰岛素。3.一种人胰岛素衍生物,其包含如在权利要求1-2任一项中定义的人胰岛素类似物,其中该置换半胱氨酸与甲基聚乙二醇马来酰亚胺分子(MM(PEG))或与N-乙基马来酰亚胺分子(NEM)共价连接。4.根据权利要求3所述的人胰岛素衍生物,其选自:A21C-MM(PEG)12人胰岛素,A21C-MM(PEG)12desB30人胰岛素,A21C-NEM人胰岛素和A21C-NEMdesB30人胰岛素。5.一种制备人胰岛素类似物的方法,所述方法包括下述步骤:培养宿主细胞,该宿主细胞包含编码如在权利要求1-2任一项中定义的人胰岛素类似物的前体的核酸序列。6.根据权利要求5所述的方法,该方法另外包括下述步骤:将该前体转化成如在权利要求1-2任一项中定义的成熟的人胰岛素类似物。7.根据权利要求6所述的方法,其中在4...

【专利技术属性】
技术研发人员:TN温特TB克杰德森F胡巴勒克KJ詹森
申请(专利权)人:诺沃—诺迪斯克有限公司哥本哈根大学
类型:
国别省市:

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