一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法。它先将组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到含有蔗糖、DMSO和谷胱甘肽的冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。本发明专利技术先将组织用匀浆机处理成乳糜状，有利于冷冻保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；同时冷冻液中添加的非渗透性保护剂蔗糖，也有利于组织细胞内的水分脱出；加入抗氧化物质谷胱甘肽，有助于减轻氧自由基对细胞内蛋白的破坏作用。解冻后组织块在培养瓶内直接接种，贴壁存活率在96%以上。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。它先将组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到含有蔗糖、DMSO和谷胱甘肽的冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。本专利技术先将组织用匀浆机处理成乳糜状，有利于冷冻保护剂渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；同时冷冻液中添加的非渗透性保护剂蔗糖，也有利于组织细胞内的水分脱出；加入抗氧化物质谷胱甘肽，有助于减轻氧自由基对细胞内蛋白的破坏作用。解冻后组织块在培养瓶内直接接种，贴壁存活率在96%以上。【专利说明】
本专利技术涉及一种生物冷冻保存技术，具体是。
技术介绍
随着生物技术的快速发展，细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学、畜牧学等生命科学领域，成为科研或生产中不可或缺的技术手段。目前，动物机体几乎所有的组织经简单机械或蛋白酶处理后接种到培养瓶中，在适宜的培养条件下都能增殖扩繁(SpierRE.Large-scale mammalian cell culture: methods, applications and products.CurrOpinBiotechnol.1991 Jun:2(3):375-9)。然而研究表明，这些细胞在体外培养的传代次数不能过多，否则会出现细胞生长缓慢、老化以及生物学功能逐渐丧失等不良现象。因此，如果试验或生产中要重复进行、多次培养细胞时，那就需要不断采集新鲜组织。由于细胞培养时所取组织应该尽可能无细菌或病毒污染、同时具有较强的增殖活性，所以取样时通常将组织放在含抗生素的液体如磷酸盐缓冲液(PBS )或生理盐水中保存，尽快(3-4小时内)送回实验室处理。如果取样现场距离实验室较远或交通不方便的情况下，组织在液体中保存时间过长，那么会造成细胞活性降低，接种后细胞生长缓慢；而且由于取样通常并不是在无菌环境中，时间过长也会造成液体中细菌大量增殖，培养后容易发生污染。因此，如果能将组织进行冷冻保存，在下次细胞培养时直接解冻、复苏组织而不需再次取样，这样就极大地避免了麻烦及浪费，也能够最大限度地利用材料；而且如果所取样品为珍稀、甚至是濒危灭绝动物的稀缺组织，冷冻保存组织的意义就更不可估量。组织冷冻保存时，渗透性冷冻保护剂如二甲基亚砜(DMS0)、乙二醇或甘油等必须渗透进入细胞质中才能起到保护作用，防止组织细胞内冰晶的生成。然而如果组织过大，则不利于冷冻保护剂穿透进入，影响冷冻保存效果。尽管目前有组织块冷冻保存成功的报道(孙苏军，安志兴，彭新荣， 张涌.山羊乳腺组织块冷冻保存实验，西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33(4):5-8)，但该冷冻方法操作过程非常繁琐、费时，具体表现为:先加基础液，冰上预冷15min，放入组织块后在摇床上平衡6h ;分两次添加DMSO ;冷冻时0°C平衡lh, _20°C平衡2h。同时保存组织块的数量较少(每管仅冻存6块)，而且复苏后组织块的存活率(最高存活率为89.8%)还需进一步提高。
技术实现思路
为了解决细胞培养时组织取样存在的问题，改善目前组织块冷冻保存方法存在的技术缺陷，本专利技术提供了。本专利技术在冷冻前先将组织处理成小的组织块，这步处理实际上等同于细胞培养时的组织块剪碎处理，组织块解冻后就可直接接种到培养瓶内培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。该方法操作步骤简单、花费时间短，一次能冻存较多数量的组织块，复苏后组织块贴壁存活率高达96%以上。本专利技术的技术方案是:，其特征是，先将新取的动物组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中-80°C超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。具体包括以下步骤: (1)冷冻液组分与配制 每 100ml 冷冻液含有:二甲基亚砜(DMSO) 9-11ml、Supercool X-1000 0.8-1.5 ml、胎牛血清(FBS) 15-20 ml、谷胱甘肽 0.15-0.25g、蔗糖 1-2g 和 DMEM/F12 液 75.2-67.5ml ;冷冻液经0.22微米滤膜过滤后4°C保存； (2)组织匀浆处理 在无菌超净台内首先将组织放在平皿中修剪成1.0-1.2cm3的块状，然后用PBS液彻底冲洗5-8遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，这时组织块成乳糜状； (3)组织块的冷冻 冷冻时，先用吸管将乳糜状组织块放入离心管内，根据组织块的体积加入8-10倍量的冷冻液混匀，然后按每管5毫升分装到冻存管中，之后放置在冷冻保存盒中_80°C超低温冰箱过夜，次日将冻存管转入液氮中长期保存(注:从加入冷冻液到将冷冻保存盒放置在超低温冰箱中整个操作时间在5-8分钟内完成，且室温维持在22-25°C)。解冻方法:解冻时依次经过解冻液、培养液离心洗涤，之后组织块可直接接种培养或经蛋白酶消化成单个细胞后培养。(1)解冻液组分与配制 每100ml解冻液含有:FBS 10-15ml、谷胱甘肽0.15-0.25g、蔗糖2-3g和DMEM/F12液90-85ml，经0.22微米滤膜过滤后4°C保存； (2)解冻时，先将冻存管从液氮中取出，放在38-39°C水浴中溶解，用吸管吸取组织块放入离心管中，加入4-5倍量解冻液轻轻混匀后静置3-5分钟，然后离心(800转/分钟、3分钟)去掉上清液,之后再加入4-5倍量培养液轻轻混匀后离心(800转/分钟、3分钟)并去掉上清液，这时可将组织块直接接种到培养瓶中或经蛋白酶消化成单个细胞，加入培养液后放CO2培养箱内培养。本专利技术的有益效果是:(1)本专利技术先将组织用匀浆机处理成乳糜状，这种处理不仅比已报道的徒手切块剪碎省时、省力，而且使单个组织块更均匀、细小(每块直径在0.1-0.2 mm之间)，有利于冷冻保护剂DMSO渗透进入组织细胞内，使细胞内水分脱出；同时冷冻液中添加的非渗透性保护剂蔗糖，也有利于组织细胞内的水分脱出，所以冷冻时能有效地防止组织细胞内冰晶的生成。(2)本专利技术在冷冻液和解冻液中加入抗氧化物质谷胱甘肽，有助于减轻氧自由基对细胞内蛋白的破坏作用，将冷冻损伤降到最低。解冻后组织块如果在培养瓶内直接接种，贴壁存活率在96%以上，高于已报道的89.8%。如果用蛋白酶消化成单个细胞后经台盼蓝染色，活细胞率为92.8%，与新鲜组织消化后活细胞率为94.6%差异不显著；(4)本专利技术方法已在山东省农业科学院畜牧兽医研究所内部推广使用，普遍认为是一种省时省力的组织冷冻保存方法。【专利附图】【附图说明】图1为实施例1贴壁约90-100%的肌肉细胞生长图片(相差显微镜下放大100倍观察)。图2为实施例2贴壁约90-100%的乳腺细胞生长图片(相差显微镜下放大100倍观察)。【具体实施方式】实施例1 1、冷冻液配制 将9毫升DMSO, I毫升Supercool X-1000、18毫升FBS,0.2克谷胱甘肽、1.2克蔗糖溶解在72毫升DMEM/F12液中，经0.22微米滤膜过滤后4°C保存备用。2、解冻液配制 将12毫升FBS、0.2克谷胱甘肽、3克蔗糖溶解在88毫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞培养的组织块的冷冻保存方法，其特征是，先将新取的动物组织匀浆处理成乳糜状，然后加入冷冻液混匀，分装到冷冻管中，之后放置在冷冻保存盒中?80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存；所述冷冻液的组分为：每100ml冷冻液含有：二甲基亚砜9?11ml、Supercool?X?1000?0.8?1.5?ml、胎牛血清15?20?ml、谷胱甘肽0.15?0.25g、蔗糖1?2g?和DMEM/F12液75.2?67.5ml；冷冻液经0.22微米滤膜过滤后4℃保存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭秀文，游伟，靳青，刘桂芬，刘晓牧，宋恩亮，万发春，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：