本发明专利技术涉及用于高效乳酸生产的材料和方法。本发明专利技术涉及一种分离的遗传修饰的E.Coli菌株，包括以下修饰：i)乙酸激酶基因的失活或缺失；ii)延胡索酸盐还原酶基因的失活或缺失；iii)丙酮酸甲酸裂解酶基因的失活或缺失；iv)醇脱氢酶基因的失活或缺失；以及v)甲基乙二醛合酶基因的失活或缺失。本发明专利技术还涉及一种遗传修饰的E.Coli菌株，包括甲基乙二醛合酶基因(mgsA)的失活或缺失。本发明专利技术还涉及包括该菌株的组合物以及用其生产D-(-)-乳酸盐或D-(-)-乳酸的方法。这些转化的E.Coli对于提供增加食品及工业应用中使用的乳酸供应很有用。
【技术实现步骤摘要】
用于高效乳酸生产的材料和方法本申请是申请日2006年8月10日、标题为“用于高效乳酸生产的材料和方法”申请号200610109332.9的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求于2005年8月10日提交的美国临时申请系列号第60/706,887号、2006年1月24日提交的系列第60/761,576号、以及2006年5月11日提交的系列号第60/799,619号的权益。政府支持本专利技术是在政府的支持下完成的，其由能源部资金支持，批准号为USDOE-DEFG02-96ER20222；以及由能源部联合美国农业部资金支持，批准号为USDA&DOEBiomassRDIDEFG36-04GO14019。本专利技术还得到来自美国农业部的政府支持，批准号为01-35504-10669和00-52104-9704。政府对本专利技术具有一些权利。
技术介绍
乳酸通常用作用于保存、增加风味和酸味的食品添加剂。乳酸还用于制造可生物降解塑料，即聚乳酸(PLA)。PLA作为石油基产品的可更新替代品的应用迅速扩大(Agrawal,2003)。PLA的物理性能和生物降解速率可通过调整手性底物(D-乳酸和L-乳酸)的比率加以控制(Narayananetal.,2004)。估计每年全球乳酸市场超过100,000吨，并且有望在接下来的几年内随着新的PLA设备投入运行会有显著增长。例如，对可生物降解的溶剂乳酸乙酯(一种乳酸衍生物)的需求有望在近年内有显著增长。据估计，乳酸酯有可能代替美国每年使用的380万吨溶剂的80%。这种溶剂无毒并且具有许多有益的应用，包括用于电子制造、油漆和涂料、纺织品、清洁剂和脱脂剂、粘合剂、印刷、以及脱墨。生产乳酸时，人们常常优选发酵方法而非化学合成，因为其得到的是D和L异构体的混合物。微生物发酵的产物依赖于所使用的有机体。微生物发酵可产生两种异构体的混合物或者立体专一形式的光学纯乳酸。希望的产物的立体专一性依赖于其计划的用途。采用乳酸杆菌(Lactobacilli)的细菌发酵通常用于乳酸的工业生产，但是这些发酵很少产生光学纯产物。另外，这些细菌需要复杂营养的性质要求将相当大量的补充营养素添加到生长培养基，增加了额外费用并且使纯化更加困难。此外，用于生产乳酸的发酵方法效率严重不足，必须加以改进以确保上述预期市场扩张的经济可行性。尽管描述过重组酿酒酵母菌(Saccharmycescerevisiae)菌株含有来自乳酸杆菌或者牛源(bovineorigins)乳酸脱氢酶(ldh)基因(PatentWO99/14335andAdachietal.,1998)，但是酵母菌不能生产可观水平的乳酸。虽然能够生产达2-4%(w/v)的乳酸，但是这些菌株显示出较差的生产能力并且相当一部分葡萄糖转化成乙醇。丝状真菌米根霉(Rhizopusoryzae)(也称作少根霉(R.arrhizus))也用于乳酸的工业生产。米根霉能够在化学成分确知的培养基(chemicallydefinedmedium)中将葡萄糖有氧地(aerobically)转化为大量的光学纯L-(+)-乳酸。之所以持续研究通过根霉的乳酸生产，主要是因为在基本生长培养基中容易进行产物纯化以及真菌利用复合碳水化合物和戊糖的能力(美国专利第4,963,486号)。这使得可利用真菌将低价值的农业生物质转化为乳酸。遗憾的是，通过对根霉和其它真菌的遗传修饰来改变乳酸生产的能力比较有限。基于大肠杆菌K-12的生物催化剂已经被改造用于D-(-)-乳酸(盐)(lactate)生产，但是不能将复合或基本培养基中10%的葡萄糖或蔗糖发酵完全(Changetal.,1999;Dienetal.,2001;Zhouetal.,2003;ZhuandShimizu2004)。人们开发了一种大肠杆菌生物催化剂，即SZ63(pLOI3501)，其通过在质粒上功能化地表达来自大肠杆菌B的cscR’cscA’cscKB’基因而用于蔗糖发酵(Shuklaetal.2004)。尽管能够有效地发酵5%的葡萄糖或蔗糖，但是这种生物催化剂不能彻底代谢更高的糖浓度并且为了质粒的维持需要连续进行抗生素选择。由大肠杆菌菌株B衍生的其他生物催化剂，如KO11(保藏编号：ATCC55124)，具有天生的发酵蔗糖的能力(Moniruzzamanetal.,1997)。同菌株SZ63一样，这种生物催化剂不能完全地代谢更高糖浓度并且为了质粒的维持需要连续进行抗生素选择。因此，为了减少与大量生产型化学品的基于生物生产相关的费用，对于具有增加发酵速度、产物效价和产率的改进的乳酸生物催化剂仍然存在需求(Arntzenetal.,1999;Chotanietal.,2000;Dattaetal.,1995;HofvendahlandHahn-Hagerdal,2000;andOharaetal.,2001)。
技术实现思路
本主题专利技术提供了在乳酸生产中非常有用的新型微生物。另外，本主题专利技术还提供了新型构建体，用于转化大量寄主生物中的任何一种，优选大肠杆菌，使该寄主生物在可发酵培养基中培养时表达和(或)抑制一些基因，从而产生乳酸。因此，本主题专利技术的材料和方法可用来提高寄主生物中的乳酸生产，从而增加用于食品和工业应用中的乳酸供应。在一些具体实施方式中，构建了产乙醇(ethanologenic)的大肠杆菌(本文中也称为大肠杆菌E.coli)KO11的衍生物用于D-(-)-乳酸(盐)(lactate)的生产。在本专利技术的另外的具体实施方式中，E.coli根据本主题专利技术进行改造，用于L-(+)-乳酸(盐)的生产。根据本主题专利技术，通过去掉编码竞争途径的基因接着通过基于生长选择发酵葡萄糖和(或)蔗糖的性能改善的突变体，可以制得基于E.coliKO11的新型生物催化剂。本专利技术改造的微生物优选含有利用蔗糖的天然基因。本专利技术的一些改造的E.coli菌株可发酵10%的葡萄糖或蔗糖，而生产超过1摩尔D-(-)-乳酸盐/l的发酵液，根据发酵液的不同，基于代谢的糖的产率在约88%到约95%的范围内。本专利技术的其他改造的E.coli菌株可发酵葡萄糖或蔗糖而生产L-(+)-乳酸盐。本专利技术其他的优点根据随后的描述将变得显而易见。附图说明图1A-1F用图示阐明了本专利技术一个具体实施方式与菌株SZ63相比之间活性的差异。图2A-2D图解阐明了发酵条件下在NBS无机盐培养基中通过本专利技术各种具体实施方式的乳酸生产进程(图2A：10%葡萄糖(NBS，SZ132)；+和-1mM甜菜碱；图2B：10%蔗糖(NBS，SZ132)；+和-1mM甜菜碱；图2C：SZ186NBS10%葡萄糖；+和-1mM甜菜碱；图2D：SZ186NBS10%蔗糖；+和-1mM甜菜碱；SZ186是改进的菌株，更纯净的产物，更高的产率。)。图3A-3B图解阐明了通过本专利技术一个具体实施方式的乳酸生产过程中甜菜碱增加耐酸性和耐糖性的能力(图3A：甜菜碱增强乳酸盐耐性；图3B：甜菜碱增强葡萄糖耐性；甜菜碱增加耐酸性和耐糖性)。图4A-4B图解阐明了本专利技术的一个具体实施方式适应无机培养液(mineralmedia)的能力(图4A：细胞生长(OD550nm)；图4B：生产的乳酸盐。SZ186对无机(盐)培养基的适应，得到菌株S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的遗传修饰的E.Coli菌株，包括以下修饰：i)乙酸激酶基因的失活或缺失；ii)延胡索酸盐还原酶基因的失活或缺失；iii)丙酮酸甲酸裂解酶基因的失活或缺失；iv)醇脱氢酶基因的失活或缺失；以及v)甲基乙二醛合酶基因的失活或缺失。
【技术特征摘要】
2005.08.10 US 60/706,887;2006.01.24 US 60/761,5761.一种分离的遗传修饰的E.Coli菌株，包括以下遗传修饰：i)乙酸激酶的酶活性失活；ii)延胡索酸盐还原酶的酶活性失活；iii)丙酮酸甲酸裂解酶的酶活性失活；iv)醇脱氢酶的酶活性失活；以及v)甲基乙二醛合酶的酶活性失活，所述菌株产生D-(-)乳酸。2.一种组合...
【专利技术属性】
技术研发人员：周胜德，朗尼·奥尼尔·英格拉姆，基尔内塔姆·T·尚穆加姆，洛兰·P·约马诺，塔米·B·格拉巴尔，乔纳森·C·穆尔，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会公司，
类型：发明
国别省市：
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