调节PD1的方法和组合物技术

本文公开了调节PD1基因表达的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调节PD1的方法和组合物对联邦政府资助研究下所获专利技术的权利声明不适用。
本专利技术属于基因组工程和核酸酶识别领域。专利技术背景已经证实，核酸酶，包括工程化为与靶位点特异性结合的锌指核酸酶和归巢内切核酸酶(例如SceI)，在基因组工程中有用。例如，锌指核酸酶(ZFN)是包含与核酸酶结构域融合的定点工程化锌指的蛋白质。这种ZFN已经成功用于多个不同物种的基因组修饰。见，例如，美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和国际公布WO07/014275，其公开内容通过引用整体并入用于所有目的。这些ZFN可用于在靶核苷酸序列中产生双链断裂(DSB)，这使靶基因座处同源重组的频率增加1000倍以上。另外，通过非同源末端连接(NHEJ)不精确修复定点DSB也可导致基因破坏。产生两个这种DSB导致任意大区域缺失。已经证实程序性死亡受体(PD1，也称为PDCD1)与响应于慢性抗原调节T细胞活化和T细胞耐受之间的平衡有牵连。HIV1感染期间，已经发现在CD4+T细胞中PD1的表达增加。据认为，与HIV感染情况一样，当在慢性抗原暴露存在下观察到T细胞功能障碍时，PD1上调从某种程度上与T细胞耗竭(定义为关键效应子功能逐渐丧失)相关联。PD1上调可能还与慢性病毒感染期间这些同类细胞中凋亡增加相关(见Petrovas等，(2009)JImmunol.183(2):1120-32)。PD1也可能在肿瘤特异性逃离免疫监视中起作用。已经证明，在慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)中PD1在肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中高度表达。在黑素瘤浸润T淋巴细胞(TIL)中PD1也上调(见Dotti(2009)Blood114(8):1457-58)。已经发现肿瘤表达PD1配体(PDL)，当结合CTL中PD1的上调时，PD1配体可为T细胞功能性丧失和CTL不能介导有效抗肿瘤反应的促成因子。研究人员已经证实，在慢性感染了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的小鼠中，施用抗PD1抗体阻滞PD1-PDL相互作用并且能够恢复一些T细胞功能性(增殖和细胞因子分泌)，并导致病毒载量降低(Barber等(2006)Nature439(9):682-687)。PD1失调也可能在自身免疫性疾病中起作用。PD1(尤其是PD1.3)的SNP也与全身性红斑狼疮(SLE)风险升高相关。已经证实，SLE患者具有更高频率的PD1.3PD1等位基因，并且这些患者显示在其活化CD4+T细胞上PD1表达减少(见Bertsias等，(2009)ArthritisRheum.60(1):207-18)。因此，仍需要另外的PD1靶向调节剂，例如可用于研究和治疗应用的PD1靶向核酸酶或转录因子。专利技术概述本专利技术涉及研发PD1靶向核酸酶，例如工程化大范围核酸酶和锌指核酸酶(ZFN)。本专利技术证明对人和啮齿动物PD1有特异性的活性锌指蛋白和包括含这些PD1特异性锌指蛋白的锌指蛋白转录因子(ZFP-TF)或锌指核酸酶(ZFN)的融合蛋白。包含本专利技术的PD1特异性锌指蛋白的蛋白质可用于研究和治疗目的，包括用于治疗其中PD1表达异常，或其中由于PD1配体过表达而异常利用PD1途径的任何疾病或病症。例如，在慢性传染性疾病和恶性肿瘤中，锌指核酸酶靶向T细胞中的PD1基因座可用于阻滞PD1依赖性免疫抑制。可选地，可使用ZFN依赖性靶向插入野生型序列修补缺陷型PD1基因座，或可使用锌指蛋白转录因子(ZFPTF)调节(例如，上调或下调)缺陷型PD1表达。进一步地，可使用靶向PD1基因座的ZFPTF调节野生型PD1基因。在本专利技术的另一方面，融合蛋白包含对人PD1基因有特异性的锌指核酸酶(ZFN)。在某些实施方案中，核酸酶融合蛋白的锌指结构域包含表1所示的非自然生成的识别螺旋和/或与表2所示的靶位点结合。又一方面，本文提供了能够调节PD1基因表达的ZFP-TF。在某些实施方案中，ZFP-TF的锌指结构域包含表1或5所示的非自然生成的识别螺旋和/或与表2或6所示的靶位点结合。另一方面，本文提供了调控PD1基因的方法和组合物。在某些实施方案中，所述方法包括将包含工程化为与PD1基因中的靶位点结合的锌指蛋白的融合蛋白(或编码融合蛋白的多核苷酸)引入来自有特征在于由PD1配体过表达引起PD1表达异常和/或PD1途径不良使用的疾病或病症的患者的细胞中。所述方法用于治疗和/或预防慢性感染，例如HIV和HCV。类似地，所述方法和组合物可用于治疗和/或预防癌症和恶性疾病。可治疗和/或预防的癌症的非限制性实例包括肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、脑癌等。本文所述的方法和组合物可用作独立治疗，或可与其它抗病毒或抗癌疗法联合使用。这些方法和组合物可与抗病毒或抗癌疗法一起以连续方式提供，或可同时施用。提供的方法和组合物可用于调节患有自身免疫性疾病的患者体内的PD1表达，或者如果该患者携带缺陷型或有害等位基因，可用于通过整合野生型PD1等位基因或特征改变的PD1等位基因治疗此类患者。可构建细胞系以特异性改变所述PD1基因序列以产生可改变PD1基因的调控或功能性的治疗性化合物的筛选系统。附图简述图1是示出了通过测量将所指ZFN引入这些细胞中时诱导通过非同源末端连接(NHEJ)插入的突变百分比的基于Cel-1SURVEYORTM核酸酶测定法测定，使用PD1特异性锌指核酸酶对人PBMC中PD1基因的破坏的图。用各自使ZFN12942与DNA相反链上结合的不同ZFN变体组合并且在与具有12942的靶基因座结合后将形成功能核酸酶的ZFN对处理细胞。以下各图中指出了这一对中第二ZFN的SBS数量。每一对最左边一栏示出了在37℃下孵育的细胞核转染后3天的NHEJ百分比。在所示每一对从左边数第二栏示出了在37℃下孵育的细胞核转染后10天的NHEJ百分比。在所示每一对从右边数第二栏示出了在30℃下孵育的细胞核转染后3天的NHEJ百分比并且在所示每一对最右边一栏示出了在30℃下孵育的细胞核转染后10天的NHEJ百分比。图2描绘了用靶向外显子1的PD1特异性ZFN对12942和12947处理后，测定CD8+T细胞中PD1基因座的序列的分析结果。用黑体大写字母描绘了插入。用(-)表示缺失。如图可见，由于经NHEJ修复DSB，在ZFN切割位点附近观察到若干插入和缺失。图3描绘了从具有鼠PD1特异性ZFN的PmelTCR转基因/Rag1-/-小鼠得到的脾细胞转染后的结果。用抗CD3抗体刺激细胞，然后为PD1染色。图中示出了每一组中的PD1阳性CD3+CD8+细胞百分比和每一组的中值PD1荧光性，并且下面以表格形式表示数据。如图中可见，在接受了PD1特异性ZFN的细胞中，即使在CD3刺激存在下，PD1表达降低。图4证明在稍后的时间点，PD1表达减少明显。在CD3刺激72h后收获细胞，并且为PD1染色。上部直方图示出了每一组中PD1阳性CD3+CD8+细胞百分比和每一组的中值PD1荧光性。下图示出了PD1/CFSE细胞的频率。该图证明，即使在CD3刺激72h后经PD1特异性ZFN处理本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.11.17 US 12/927,5571.一种与PD1基因中的靶位点结合的锌指蛋白，所述锌指蛋白包含5或6个锌指蛋白识别序列，从N-末端到C-末端排列，其中所述识别区域包含以下氨基酸序列：(i)F1:RSSALSR(SEQIDNO:23)；F2:RPLALKH(SEQIDNO:24)；F3:RNDHRKN(SEQIDNO:12)；F4:TRPVLKR(SEQIDNO:25)；和F5:DRSALAR(SEQIDNO:9)；其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(ii)F1:RPSTLHR(SEQIDNO:27)；F2:RSDELTR(SEQIDNO:28)；F3:RNNNLRT(SEQIDNO:29)或TNWHLRT(SEQIDNO:30)或RTPHLTL(SEQIDNO:31)或RSAQLAT(SEQIDNO:32)或RCTHLYL(SEQIDNO:33)或RPTQRYS(SEQIDNO:34)或RANHREC(SEQIDNO:35)或RMGRLST(SEQIDNO:39)或RANHRVC(SEQIDNO:42)或RSTHLLG(SEQIDNO:43)；F4:TRPVLKR(SEQIDNO:25)；和DRSALAR(SEQIDNO:9),其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(iii)F1:RKFARPS(SEQIDNO:36)；F2:RNFSRSD(SEQIDNO:37)；F3:HPHHRMC(SEQIDNO:38)；F4:TRPVLKR(SEQIDNO:25)；和F5:DRSALAR(SEQIDNO:9),其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(iv)F1:RPSTLHR(SEQIDNO:27)；F2:RSDELTR(SEQIDNO:28)；F3:RHSRLTT(SEQIDNO:40)；F4:TRPVLMR(SEQIDNO:41)；和F5:DRSALAR(SEQIDNO:9)，其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(v)F1:RNAALTR(SEQIDNO:45)；F2:RSDELTR(SEQIDNO:28)；F3:RSCGLWS(SEQIDNO:44)或RHHHLAA(SEQIDNO:48)；RPMHLTN(SEQIDNO:49)；或RSPHLYH(SEQIDNO:50)；或RLPALLS(SEQIDNO:53)，F4:TRPVLKR(SEQIDNO:25)；和F5:DRSALAR(SEQIDNO:9)，其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(vi)F1:RNAALTR(SEQIDNO:45)；F2:RSDELTR(SEQIDNO:28)；F3:RCEALHH(SEQIDNO:51)F4:TRPVLKR(SEQIDNO:25)；和F5:DRSAQAR(SEQIDNO:52)或DRSALAR(SEQIDNO:9)，其中所述锌指蛋白结合SEQIDNO:60所示的靶位点；(vii)F1:HNAALTR(SEQIDNO:54)；F2:RSDELTR(SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·D·格雷戈里，M·C·霍尔姆斯，M·C·孟德尔，X·孟，D·帕斯乔恩，A·瑞克，F·诺弗，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：
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