本发明专利技术公开了一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，均采用含酵母和蛋白胨的无抗生素培养基，采用高压均质机破菌，经过变性、复性和层析，得到高纯度G-CSF原液。本发明专利技术的生产方法生产周期短，生产效率高，生产规模大，特别适于工业化生产，降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体来说是。
技术介绍
重组人粒细胞刺激因子(granulocytecolony-stimulating factor, G-CSF)是指特异作用于造血系统中粒祖细胞，促机其增殖，向成熟中性粒细胞分化，并维持细胞的存活及其生物功能的一种造血生长因子，是刺激骨髓细胞集落形成的集落刺激因子的一种。对骨髓移植时的中性白细胞增加、癌症化疗时引起的严重中性粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均有明显疗效。采用基因工程技术重组G-CSF的生活学活性与天然的相似，可以大规模生产，以满足临床需要。目前，比较常用的方法是利用大肠杆菌表达外源蛋白，多以不溶性包涵体的形式存在，由于包涵体不具有生活学活性，因此还需要经过变性、复性处理，恢复其生物学活性，再经过纯化处理，得到原液。中国专利文献CNY718739A公开了一种“重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法”，该方法包括:a.选用工程菌DH5 a - PBV220 一 hGCSF菌株进行发酵培养；b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物对超滤所得物进行进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其纯度达到98%以上、比活性不低于4.0X 108IU/mg。本制备方法为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。然而，上述方法中 ，以工程菌DH5a — PBV220 — hGCSF菌株作为种子，即使在培养时采用了抗生素氨苄青霉素以提高表达量，其所得rG-CSF蛋白占菌体总蛋白比例在40%左右，而且由于抗生素对环境的不友好，采用了抗生素技术的生产废液的处理成为新的问题。并且，其生产过程复杂，生产周期比较长，生产效率低，发酵罐规模只有20L不适合大规模生产。具体表现为:基本发酵时间为培养8小时,米用超声破菌时间长,分离洗漆5次,两次复性要超过116小时。由于洗涤和复性溶液成份复杂，给后续层析纯化增加了难度，使得第二次复性需要在2_8°C条件下复性96小时以上，且复性完后需经离心处理才能上柱。同时，采用超声破菌，控制超声功率和时间难度大，超声不足不能完全释放重组蛋白，而超声时间太长或功率太大，会使蛋白炭化。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种适合工艺化，能够提高生产量、缩短生产周期，是高密度快速生产重组人粒细胞刺激因子的方法。本专利技术采用如下技术方案:，依次包括(I)对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，(2)对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，得到精制包涵体；(3)对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；(4)对变性所得物进行复性处理；(5)对复性所得物进行不需离心分离直接进行层析纯化处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于:所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为PKG931/HB101 ;所述工程菌株的培养包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤:①.菌种复苏:将工程菌种接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为30°C，150r/min，培养 12-14 小时；②.一级种子液培养:将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30°C，150r/min，培养9_11小时；③.二级种子液培养:将一级种子液按增加1%的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为:转速100-300rpm/min，通气30L/min，罐压0.1-0.2bar，温度30°C，溶氧不低于50%，培养3-5小时，至OD6tltl值至为1.0-2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；所述发酵罐培养包括如下子步骤:①.发酵前的准备:采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度115°C，30min，发酵罐自动在线灭菌； ②.发酵罐培养:灭菌后，待培养基温度降到30°C时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为:培养温度30°C，发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30%(w%)以上，各参数调节范围为:转速200— 450r/min、通气量100_400L/min、罐压0.1-0.3bar,培养4小时开始诱导表达；③.诱导发酵:诱导温度为37_42°C，诱导4小时，结束发酵，经离心收集发酵产物，收集到的发酵湿菌体可以在_20°C的冰箱中保存。通过上述方法控制培养条件，通过对pKG931/HB101菌株发酵培养，G-CSF平均湿菌体收率可达100-120g/L，其rG-CSF蛋白占菌体总蛋白的50%以上，而且发酵周期短，采用500L发酵罐，生产量大，是一种高密度快速生产方法。上述发酵罐培养子步骤②和③中，通过补加氨水控制PH为6.0-7.0，诱导后即开始补料，补料速度为每小时补加补料培养基5L。所述液体LB培养基的组分及配比为:10g/L酵母粉+10g/L蛋白胨+5g/L氯化钠。所述发酵培养基浓缩液的组分及配比为:3000g酵母粉+3000g蛋白胨+1500gKH2PO4.2H20+2000g Na2HP04+500g NH4Cl+250g NaCl+5000g 葡萄糖 +62.5g MgCl2+6.25gCaCl2。所述发酵补料培养基的组分及配比为:100g/L酵母粉+100g/L蛋白胨。上述各种培养基，均未米用抗生素，是一种环境友好培养基。所述步骤(2)中对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，为克服超声破菌的不足，本专利技术采用高压均质机进行破菌，其子步骤为:①包涵体提取:用25mmol/L Tris-HCl-EDTA溶液将菌体悬浮利用高压均质机加压至500-600bar进行菌体破碎，然后用管式离心机连续流离心的方法收集G-CSF包涵体；②包涵体洗涤:先用25mmol/L Tris_HCl+2M盐酸胍溶液+0.5%(w%)曲拉通X-100将沉淀离心洗涤2次，再用纯化水将沉淀离心洗涤2次，洗涤过程使用J-26XP离心机离心收集沉淀，得精制G-CSF包涵体。本专利技术在包涵体提取时利用高压均质方法取代了传统的超声破碎方法，高压均质机的工作原理是将未均质的样品先以高压低流速的状态进入均质阀区，接着样品经过均质阀与阀座之间的狭缝，这时候样品的压力也急速的降低，而样品的流速迅速的增加，此时产生剧烈的能量，而此能量是由扰流现象及不同的压力差所引起，此能量便会将固体颗粒撕碎。之后，均质过的样品会再撞击冲击环，减弱能量之后进入样品收集槽，高压均质方法不仅具有速度快、处理量大的特点，而且可以通过多次循环破碎将菌体碎片乳化成极微小的颗粒，再通过离心的方法很容易将其去除，可收集到纯度较高的包涵体，再用高浓度的尿素溶液将包涵体溶解，其纯度可达到90%以上,从而减小了后续纯化的难度。本专利技术包涵体洗涤过程的难点在于包涵体中除本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人粒细胞刺激因子的生产方法，包括（1）对大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株进行培养获得包涵体，（2）对发酵培养所得菌体进行包涵体的提取和洗涤，得到精制包涵体；（3）对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；（4）对变性所得物进行复性处理；（5）对复性所得物进行层析纯化处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于：所述大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子的工程菌株为pKG931/HB101，培养方法包括扩增培养和发酵罐培养，其中扩增培养包括以下子步骤：①.菌种复苏：将工程菌株进行菌种复苏，将种子液接种到液体LB培养基中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养12?14小时；②.一级种子液培养：将复苏后的种子液接种到含液体LB培养基的摇瓶中培养，设定摇床温度为30℃，150r/min，培养9?11小时；③.二级种子液培养：将一级种子液按增加1%的体积比方式接种到含30L液体LB的贝朗50L发酵罐中，罐培养控制条件为：转速100?300rpm/min，通气30L/min，罐压0.1?0.2bar，温度30℃，溶氧不低于50%，培养3?5小时，至OD600值至为1.0?2.0时结束培养，取样镜检观察无杂菌，菌种形态正常，即为发酵罐培养用种子；所述发酵罐培养包括如下子步骤：①.发酵前的准备：采用贝朗公司500L发酵罐，将发酵培养基浓缩液接入发酵罐并定容至500L，设定灭菌温度115℃，30min，发酵罐自动在线灭菌；②.发酵罐培养：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，将种子罐中二级种子液通过管道接种到500L发酵罐中，发酵罐培养控制条件为：培养温度30℃，发酵培养过程通过调节转速、通气量及罐压等将溶氧控制在30%以上，各参数调节范围为：转速200—450r/min、通气量100?400L/min、罐压0.1?0.3bar，培养4小时开始诱导表达；③.诱导发酵：诱导温度为37?42℃，诱导4小时，结束发酵，经离心收集发酵产物。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程度胜，桑建彬，韩明娣，龙应国，王晓建，
申请(专利权)人：北京四环生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。