团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种团头鲂β防御素基因，该基因具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了编码所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白及其制备方法，该重组蛋白具有如序列表SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术的团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌、链球菌及氨苄耐药型大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，为抗感染药物及耐药型细菌提供了一类疗效好的新药品。本发明专利技术所提供的团头鲂β防御素重组蛋白的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的化学合成方法活性较好、降低成本，缩短制备时间，有利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，涉及一种新天然抗菌肽，具体是指一种团头鲂β防御素基因及其编码的蛋白和应用。
技术介绍
细菌对传统抗生素的耐药性已成为全球关注的重大公共卫生问题。WHO将抗生素耐受描述为“影响所有国家的全球公共健康紧急事件”，而且这一问题导致全球健康问题的比例在逐渐增加，因此，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。近年来出现的抗菌肽就是一类发展潜力巨大的新型抗菌类药物，它不仅对细菌和真菌有广谱杀灭作用，而且还具有很好的抗病毒和抗肿瘤作用，另外，与传统抗生素相比，其作用机制独特，不易引起微生物的耐药性，绝大多数不损害或破坏高等动物的正常细胞，因此它极有可能成为在临床上替代抗生素来治疗细菌感染的新型药物。相比陆生动物和高等哺乳动物，鱼类的抗菌肽种类更丰富，也更具有独特性，是抗菌肽生物资源中还没有得到有效开发的巨大宝库。已有报道证实，鱼类某些抗菌肽比高等脊椎动物具有更强的杀菌活性，因此，对鱼类抗菌肽的开发利用研究具有重要的科学意义和实际应用价值。防御素是一组小的阳离子抗菌肽，根据半胱氨酸残基位置及二硫键连接方式的不同，可ct，β，Θ三种防御素，其中β防御素(β-defensin)因广泛表达于机体各组织和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线，被认为是最重要的防御素。但是天然防御素来源有限，化学合成也存在成本高、批量生产困难；防御素抗菌活性与肽分子的空间结构密切相关，体外合成的防御素与天然防御素虽然一级结构一致，但空间结构却不尽相同，因而造成活性较差。因此，采用基因工程方法制备防御素将具有很大优势。巴斯德毕赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工、修饰的特点，且发酵条件简单，表达水平高，适合高密度培养，为工业化和纯化提供极大的方便。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是从团头鲂中获得β防御素基因。本专利技术的第二个目的是将所述团头鲂β防御素基因在酵母表达系统中高效表达获得重组表达蛋白。本专利技术的第三个目的是提供重组蛋白的应用。(I)本专利技术所述团头鲂β防御素基因的获得:利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法，以团头鲂肝脏总RNA为模板，经RT-PCR得到团头鲂β防御素基因，其cDNA序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQ ID N0:1所示。 (2)编码了所述团头鲂β防御素基因的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示。(3)所述团头鲂β防御素重组蛋白(或多肽)，其制备方法为:将序列表SEQ IDNO:1所述的团头鲂β防御素基因开放阅读框(ORF))与酵母表达载体构建重组表达质粒pPICZa-BDl,电转化至毕赤酵母工程菌GSl 15中，抗生素Zeocin筛选高抗性的转化子，并用甲醇诱导表达。收集上述甲醇诱导表达的上清液，对其进行分离纯化的蛋白或多肽即为团头鲂β -防御素I重组蛋白(或多肽)。(4)本专利技术获得的团头鲂β防御素重组蛋白具有生物活性，具有抗菌作用。采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定实验证明:团头鲂β防御素重组蛋白对部分革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和部分革兰氏阴性菌如大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，而且团头鲂β防御素重组蛋白对氨苄耐药型的嗜水气单胞菌和大肠杆菌抑菌作用明显。因此，本专利技术的团头鲂β防御素可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括医药产品如抗菌药物、饲料添加剂、兽药、防腐剂等。本专利技术的有益效果:本专利技术涉及的团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌、链球菌及氨苄耐药型大肠杆菌和嗜水气单胞菌等均具有良好的抑菌活性，为抗感染药物及耐药型细菌提供了一类疗效好的新药品。本专利技术所提供的团头鲂β防御素重组蛋白的制备方法不仅易于获得纯度高的产品，而且相对于现有的化学合成方法活性较好、降低成本，缩短制备时间，有利于工业化生产。附图说明图1为团头鮮肝脏总RNA电泳结果。图2本专利技术所述团头·鲂β防御素基因RT-PCR扩增产物。1:目的基因；M:DNA分子量标准(购自大连宝生物)。图3为本专利技术所述利用表达引物扩增团头鲂β防御素基因的产物。1:目的基因；M =DNA分子量标准(购自大连宝生物)。图4为是本专利技术中团头鲂β防御素重组蛋白对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定。I:氨苄青霉素10 μ g ;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A- β -防御素转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A- β -防御素转化子诱导产物II。图5为是本专利技术中重组β防御素对嗜水气单胞菌抑菌活性测定。1:氨苄青霉素10μ g ;2:pPICZaA酵母转化子诱导产物；3:pPICZa A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图6为本专利技术中重组蛋白对无乳链球菌抑菌活性测定。1:氨苄青霉素10μ g ;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图7为本专利技术中重组蛋白大肠杆囷抑囷活性测定。1:氣节青霉素10yg;2:pPICZ a A酵母转化子诱导产物；3:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物I ;4:pPICZ a A-BDl转化子诱导产物II。图8为本专利技术的核苷酸序列。图9为本专利技术的氨基酸序列。图10为NCBI已公布的来源于不同物种的β防御素的氨基酸序列比对图。黑色方框为保守序列。图11为本专利技术中插入表达载体的核苷酸序列。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1:团头鲂总RNA的提取及cDNA的合成I)团头鲂总RNA的提取:实验用的玻璃器皿经0.1%的DEPC水处理，150°C烘烤4h。塑料器皿经0.1% DEPC水浸泡过夜，121 °C 20min高温高压灭菌。金属用具经lmol/L的NaOH浸泡2h，经0.01%的DEPC水彻底冲洗后，37 °C烘干。各试剂用无核糖核酸酶(Ribonuc I ease，RNase)的0.01% DEPC水配置。用麻醉剂MS222将团头鲂麻醉，解剖，取出肝脏，剪取0.1g肝脏提取RNA。总RNA抽提按Trizol试剂的说明书进行。提取的RNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪观察鉴定，可见清晰的三条带(图1)。总RNA样品冻存于-80°C，备用。2) cDNA (反转录产物)第一条链的合成:以提取的团头鲂肝脏总RNA为模板进行反转录，反应体系为40 μ L,即:无RNase 水 8 μ L，总RNAl5 μ L,Oligo dT (18) -Adaptor 引物 2uL,70°C下10分钟，立即冰浴冷却，之后分别加入:5 X RT 缓冲液 8 μ L，dNTP 混合液 4 μ L，RNase 抑制剂 1.5 μ L，反转录酶1.5 μ L，总计40 μ L,混匀，反转录反应条件为:42°C下20分钟，70°C下15分钟，最后4°C结束反应，4°C保存，备用。实施例2:团头鲂β防御素基因的克隆及序列分析I)引物设计根据NCBI/GenBank上已登录鱼类β防御素序列信息，根据序列的保守性，用Primer 5.0软件在cDNA序列开放阅读框(ORF)的上下游区域，设计一对引本文档来自技高网...

【技术保护点】
团头鲂β防御素基因，该基因具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：袁改玲，陈思思，张涓，黄金海，熊文静，刘小玲，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：