本发明专利技术提供了一种用于以高产率和纯度从重组大肠杆菌纯化大量人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。根据本发明专利技术的方法,可以容易地以高产率和纯度纯化与在人体中表达的天然形式相同的人粒细胞集落刺激因子而无需其他活化过程。特别地,根据本发明专利技术的纯化方法,高效地除去在大肠杆菌中表达的hG-CSF变体以得到具有高纯度的生理活性hG-CSF。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。更具体地,本专利技术涉及用于以高纯度和产率从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法,其包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀;(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离;(c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀;(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱;(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱;以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。
技术介绍
集落刺激因子(CSF)由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生,并且这些细胞广泛分布于机体中。已知的CSF包括GM-CSF、M-CSF和G-CSF。其中,GM-CSF是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,并且作用于粒细胞或巨噬细胞的干细胞以诱导它们的增殖和分化,从而刺激粒细胞或巨噬细胞的集落形成。M-CSF (巨噬细胞-CSF)是巨噬细胞集落刺激因子,并用主要行使刺激巨噬细胞集落形成的功能。G-CSF (粒细胞-CSF)是粒细胞集落刺激因子,并且刺激粒细胞的集落形成和诱导最终分化。通常而言,为了分离和纯化G-CSF,培养细胞并从培养上清液中分离G-CSF蛋白。但是,该方法存在G-CSF产率低的问题,并且因此不适于大量生产。另外,ChugaiPharmaceuticals C0.,Ltd.(日本)开发了一种通过使用包含编码hG_CSF之多核苷酸的基因组DNA或cDNA在哺乳动物细胞中产生糖基化hG-CSF的方法(韩国专利N0.47178,53723和57582)。但是,已知糖基化hG-CSF的糖链对于hG-CSF的活性而言不是必需的,并且使用哺乳动物细胞产生糖基化hG-CSF需要`昂贵的材料和设备,因此,这样的方法在经济上不可行。进行了许多尝试来通过使用原核细胞产生非糖基化hG-CSF。在这些研究中,产生了因ATG起始密码子而在其N末端连接有甲硫氨酸残基的hG-CSF,但该形式与其天然形式不同。此外,在微生物中产生的hG-CSF可以被来自宿主细胞或培养材料的杂质污染,并且就应用于高纯度药物而言,需要复杂的纯化过程。此外,当使用大肠杆菌作为宿主细胞时,大多数hG-CSF作为不溶性包涵体沉积在细胞中,而且必须使它们通过重折叠过程转化为活性形式,产率显著损失。在该过程中,诱导了部分还原、分子内二硫键形成或错误二硫键形成,因此需要繁琐的过程来将它们除去并且引起了效力的损失。一个半胱氨酸残基不参与形成二硫键,并且因此以游离形式存在,导致额外的效力损失和蛋白质溶液稳定性的下降。因此,需要开发一种用于大量产生在其N-末端没有甲硫氨酸残基并因此即使使用微生物也与天然形式相同的hG-CSF的方法。为了解决这些问题,本专利技术人在之前已报道,通过修饰大肠杆菌耐热肠毒素II的已知信号肽制备了具有高表达率的新的分泌信号肽(韩国专利N0.316347),并且用于产生天然hG-CSF。此外,本专利技术人已制备了包含重组基因的表达载体,通过连接hG-CSF基因(而非肠毒素基因)靠近大肠杆菌耐热肠毒素II的经修饰信号肽制备,并且他们已使用该表达载体转化了肠杆菌,从而通过使用微生物分泌系统在周质中表达生物活性hG-CSF(韩国专利 N0.356140)。通过使用将蛋白质分泌入周质的微生物系统,可以得到可溶形式的在N-末端没有甲硫氨酸残基的天然hG-CSF。此外,周质蛋白质通常小于总细胞蛋白质的10%,因此,与位于细胞质中的蛋白质相比,需要不那么大量的重组蛋白纯化。此外,无需细胞破碎步骤,并且可以使存在于细胞质中的糖类和核酸污染最小化。但是,因为周质产生中的低表达水平,其难以工业化。因此,迫切需要开发用于以高产率和纯度纯化表达蛋白的高效方法。
技术实现思路
技术问题因此,本专利技术人努力解决了现有技术的这些问题。结果他们发现可以通过以下来以高纯度大量产生天然人粒细胞集落刺激因子:培养重组大肠杆菌以得到分泌蛋白质,然后以下列顺序将蛋白质用于酸沉淀一阳离子交换色谱一疏水相互作用色谱一阴离子交换色谱,从而完成本专利技术。问题的解决方案本专利技术的一个目的是提供用于以高纯度和产率从重组大肠杆菌纯化人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法,其包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀;(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离;(c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀;(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱;(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱;以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。本专利技术的另一目的是提供通过上述方法从重组大肠杆菌分离和纯化的具有高纯度的生理活性无变体hG-CSF。本专利技术的有利作用根据本专利技术的方法,可以容易地以高产率和纯度纯化与在人体中表达的天然形式相同的人粒细胞集落刺激因子而无需其他活化过程。具体地,根据本专利技术的方法,高效地除去在大肠杆菌中表达的hG-CSF变体以得到具有高纯度的生理活性hG-CSF。附图简述附图说明图1示出了得自根据本专利技术的纯化方法从重组大肠杆菌的周质纯化的hG-CSF的渗透提取(osmotic extraction)、酸沉淀、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱步骤之各溶液的SDS-PAGE结果,其中泳道1:标准品泳道2: 步骤(b)首次离心的上清液泳道3:步骤(b) 二次离心的上清液泳道4:通过步骤(C)的酸沉淀得到的上清液泳道5:通过步骤(C)的过滤得到的滤出液泳道6:步骤⑷的SP-琼脂糖柱的柱流泳道7:步骤(d)的SP-琼脂糖柱的柱洗脱液I流泳道8:步骤⑷的SP-琼脂糖柱的柱洗脱液2流泳道9:步骤(e)的丁基-琼脂糖柱的柱流2流泳道10:步骤(e)的丁基-琼脂糖柱的柱洗脱液2流;图2示出通过本专利技术纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的SDS-PAGE结果O图3示出通过本专利技术纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的反相高压色並奸里5口术。图4示出通过本专利技术纯化方法的阴离子交换色谱得到的柱洗脱液的大小排阻高压色谱结果。用于实施本专利技术的最佳方式本专利技术提供了用于以高纯度简单地从重组大肠杆菌纯化大量人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)而无需其他活化过程的方法。具体地,根据本专利技术的纯化方法可包括以下步骤:(a)培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心得到细胞沉淀;(b)将含hG-CSF的上清液与步骤(a)中得到的细胞沉淀分离;(c)用酸处理步骤(b)中得到的上清液以通过过滤分离所得沉淀;(d)将步骤(C)中得到的滤出液用于阳离子交换色谱;(e)将步骤(d)中得到的洗脱液用于疏水相互作用色谱;以及(f)将步骤(e)中得到的洗脱液用于阴离子交换色谱。根据本专利技术的纯化方法,其特征在于在酸沉淀之后,将得自重组大肠杆菌的hG-CSF用于一系列色谱步骤(阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和阴离子交换色谱),从而分离适于药用的高纯度hG-CSF。在下文中,将对根据本专利技术的纯化方法的各步骤进行详细描述。步骤(a)是培养表达hG-CSF的重组大肠杆菌以通过离心获得细胞沉淀的步骤。用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员:崔圣喆,金镇基,吴映学,李钟守,
申请(专利权)人:韩美科学株式会社,
类型:
国别省市:
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