重组人胰岛素原的复性与纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种高效体积排阻色谱（HPSEC）复性与同时纯化重组人胰岛素原的方法。包括（1）将含有胰岛素原的菌体细胞经超声波细胞破碎，缓冲液洗涤和溶解于强变性剂（如8mol/L或6-7mol/L盐酸胍），由此得到粗分离的重组人胰岛素原；（2）在优化的色谱条件下含有胰岛素原的变性抽提液直接进样，采用脲浓度线性梯度洗脱一步色谱所得的目标馏分rhPI的纯度可达到96%以上，质量回收率为56.8%；（3）将含有胰岛素原馏分进一步脱盐，由此得复性与纯化更高纯度和活性的馏分。本发明专利技术所述的方法得到的重组人胰岛素原可以经色谱柱上的酶切或溶液中酶切转换为胰岛素，并且该色谱过程操作简单，重复性高，易于规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用高效体积排阻色谱(HPSEC或SEC)法复性与纯化重组人胰岛素原的方法，属于生物医药中变性蛋白复性

技术介绍
胰岛素原(ProinSUlin，PI)是由86个氨基酸组成的单链肽，其C肽的两端各自通过两个碱性氨基酸残基与胰岛素A链的N末端和B链的C末端相连。胰岛素原分子的折叠卷曲保证了三对二硫键的正确对接。在胰岛素制备中，采用胰岛素原法直接酶切后获得有活性的胰岛素已经是一种成熟的方法。因此，获得高质量回收率的具有活性重组人胰岛素原(简称:rhPI)是制备重组人胰岛素的前提。Robert B.M 等[Robert B.M, et al, Protein Expres Purif, 1999, 15:308-313]曾利用离子交换色谱(IEC)法和亲和色谱(AFC)法对rhPI包涵体蛋白进行纯化，之后用稀释法复性、酶切获得产物用RPLC法分析。而Gusarova V等[Gusarova V, et al,J Chromatogr A.2007, 1176: 157-162]报道了先利用稀释法复性rhPI，再分别用IEC法和SEC法进行两步纯化后，通过酶切转换为胰岛素。上述方法均利用稀释法复性，难于大规模进行蛋白药物的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供的一种高效、快速的复性与纯化重组人胰岛素原的方法，能够提高重组人胰岛素原的质量回收率和纯度，并可直接用于酶切为胰岛素，适用于胰岛素的规模化生产。本专利技术实现过程如下: ，包括以下步骤: (1)在大肠杆菌(疋co7i)中表达的重组人胰岛素原(rhPI)的菌体细胞经离心、超声破碎后分别用缓冲液I和II洗涤、离心溶解于强变性缓冲液中得到含有重组人胰岛素原的变性抽提液；所述缓冲液 I 为 10 20 mmol/L PBS,0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ;所述缓冲液 II 为 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ; 所述的强变性缓冲液为6.0 8.0 mol/L脲，10 20 mmol/LDTT，0.5 I mmol/LEDTA,pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 盐酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ； (2)将含有重组人胰岛素原的变性抽提液直接进样到流动相A(20 40 mmol/LPBS,O 8.0 mol/L脲，pH6.0 7.0)平衡的色谱柱，然后用含20 40 mmol/LPBS, pH6.0 7.0的流动相B线性梯度洗脱，流速为0.3 0.7mL/min，收集目标峰色谱馏分得到复性与纯化含重组人胰岛素原的色谱馏分；(3)将步骤(2)含人胰岛素原的色谱馏分直接进样，用O 10 mmol/LPBS, pH6.0 7.0的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐,持续洗脱20 40 min,流速0.5 I mL/min,得到重组人胰岛素原。上述步骤(2)中色谱柱为TSK gel 620005' 0^型(7.811111^300111111)或5即61(^\20010/300GL 型(10 mmX300 mm)。上述步骤(2)中所述洗脱方式可以采用流动相A平衡后，用流动相B线性梯度洗脱20 40 min,延长5 10 min。上述步骤(3)中所述色谱柱为HiTrap Desalting column。本专利技术的优点:本专利技术提供的利用脲浓度梯度体积排阻色谱对重组人胰岛素原复性与纯化的方法，解决了蛋白分子直接从高浓度变性剂扩散到与流动相中，而不能提供一个缓和的蛋白再折叠环境的问题，同时也克服了其他色谱方法成本高，难于放大的缺点。本专利技术在流动相中添加了小分子脲之后，在洗脱过程中，为蛋白再折叠提供了一个温和的环境，促进蛋白折叠成紧密的结构，保留时间延长，复性效率和质量回收率也得到提高。并且经过脱盐柱后更加利于后续酶切而得到胰岛素，操作简单成熟、稳定，固定相成本较低，易于控制和放大附图说明图1复性与纯化前后rhPI的SDS-PAGE分析 条带M:蛋白质分子量标准；条带1:未诱导表达的重组人胰岛素原；条带2:重组人胰岛素原诱导表达5 h后；条带3:8.0 m ol/L urea抽提液；条带4:脲浓度梯度SEC法对rhPI的纯化与复性；条带5:对一步馏分脱盐的二次纯化；条带6:标准胰岛素；条带7:酶切转化的胰岛素； 图2添加不同的脲浓度时对rhPI的复性与纯化色谱图(A )和质量回收率(B) 图(A)中横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU); 图(B)中横坐标为添加脲浓度(Urea concentration),纵坐标为质量回收率(Massrecovery)； 曲线 1: 0.0 mol/L 脲；曲线 2: 2.0 mol/L 脲；曲线 3: 4.0 mol/L 脲；曲线 4:6.0 mol/L 服；曲线 5: 8.0 mol/L 服； 图3为不同洗脱模式下对rhPI的复性与纯化 图中横坐标为保留时间(time )，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU); 曲线1:在流动相A中添加0.0 mol/L脲等度洗脱；曲线2:在流动相A中添加2.0mol/L脲等度洗脱；曲线3:在流动相A中添加2.0 mol/L脲梯度洗脱。具体实施例方式下面结合实施例和附图详细说明本专利技术的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用设备或原料皆可从市场获得。实施例1 (O重组人胰岛素原变性抽提液的准备 用万作为宿主细胞表达重组人胰岛素原(rhPI)蛋白，再将发酵菌液经离心、细胞破碎和分别用缓冲液 I (20 mmol/L PBS, I mmol/L EDTA，pH 7.4)和 II (2.0 mol/L 脲，1mmol/L EDTA, 1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS, pH 7.4)洗涤、并离心的粗纯化后，得到的包涵体溶于 8.0moI/L 脲，20 mmol/LDTT, 1.0 mmol/LEDTA, pH 8.0 (或 6 7 mol/L 盐酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0)的变性剂中，变性抽提液浓度为9.92 mg/mL, rhPI纯度为65.7 %以上，电泳见图1中条带3。(2)高效体积排阻色谱复性与纯化重组人胰岛素原 用流动相A(20 mmol/ LPBS,4.0moI/L 脲，ρΗ6.5)平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL,300 X 7.8 mm 1.D.)，变性抽提液直接进样200 μ L，在流速0.3 mL/min下进行30 min的线性梯度洗脱，直至流动相B (20 mmol/L PBS, pH 6.5)为100%,延长10 min。rhPI质量回收率为42.5%，纯度达到95%以上，色谱图见图2 (A)的曲线3，质量回收率见图2 (B)中。(3)用脱盐色谱柱二次纯化重组人胰岛素原 用0-10 mmol/LPBS, pH6.0-7.0的流本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组人胰岛素原的复性与纯化方法，其特征在于包括以下步骤：（1）在大肠杆菌中表达的重组人胰岛素原的菌体细胞经离心、超声破碎后分别用缓冲液I和II洗涤、离心溶解于强变性缓冲液中得到含有重组人胰岛素原的变性抽提液；所述缓冲液I为10～20??mmol/L?PBS，0.5～1?mmol/L?EDTA，pH?7.0～7.5；所述缓冲液II为0.5～2.0?mol/L脲，0.5～1?mmol/L?EDTA，0.5～1.0?mol/L?NaCl，10～20?mmol/L?PBS，pH?7.0～7.5；所述的强变性缓冲液为6.0～8.0?mol/L脲，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；或6～7?mol/L盐酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；（2）将含有重组人胰岛素原的变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，然后用含20～40?mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相B线性梯度洗脱，流速为0.3～0.7mL/min，收集目标峰色谱馏分得到复性与纯化含重组人胰岛素原的色谱馏分；流动相A为：20～40?mmol/LPBS，0～8.0?mol/L脲，pH6.0～7.0；（3）将步骤（2）含重组人胰岛素原的色谱馏分直接进样，用0～10?mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱20～40?min，流速0.5～1?mL/min，得到重组人胰岛素原。...

【技术特征摘要】
1.重组人胰岛素原的复性与纯化方法，其特征在于包括以下步骤: (1)在大肠杆菌中表达的重组人胰岛素原的菌体细胞经离心、超声破碎后分别用缓冲液I和II洗涤、离心溶解于强变性缓冲液中得到含有重组人胰岛素原的变性抽提液；所述缓冲液 I 为 10 20 mmol/L PBS, 0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ; 所述缓冲液 II 为 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ; 所述的强变性缓冲液 为6.0 8.0 mol/L脲，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 盐酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ； (2)将含有重组人胰岛素原的变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，然后用含20 40 mmol/LPBS,pH6.0 7.0的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王骊丽，吴溪，周慧芳，袁洁，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：