本发明专利技术属于生物医药领域,具体涉及一种重组人胰岛素原的制备方法,特别涉及一种利用扩张床吸附技术制备重组人胰岛素原的方法。本发明专利技术从复杂的含重组人胰岛素原的料液中一步捕获目的蛋白,经盐浓度梯度洗脱,能获得高纯度的胰岛素原蛋白,所得的重组人胰岛素原的纯度达到90%以上。本发明专利技术提供的方法工艺过程简单,操作方便,高流速缩短了生产时间,提高了生产效率,纯化重组人胰岛素原的收率达到85%以上,特别适合于胰岛素的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域,具体涉及,特别涉及了一种利用扩张床吸附技术制备重组人胰岛素原的方法。
技术介绍
全球糖尿病人的数量正逐年增长,预计到2025年将达到3亿,而胰岛素是至今仍广泛使用的治疗糖尿病的特效药物,因此胰岛素的消耗量也会随着递增。胰岛素的临床用药量大,每个糖尿病患者每天需使用胰岛素约1.5 2.0毫克,且终身用药,因此开发一种用于大规模低成本制备胰岛素的工艺方法具有良好的商业价值和社会意义。随着生物技术的迅猛发展,基因工程重组人胰岛素面世,较动物来源胰岛素优势更加明显,与人体内胰岛素的序列完全一致,且纯度更高,含宿主蛋白少,安全无毒副作用。现在临床上所用的重组人胰岛素主要为大肠杆菌系统和酵母系统所表达。大肠杆菌系统生产胰岛素最初由Genetech公司和Lilly公司于1982年合作完成,现在多用融合蛋白使其形成包涵体,包涵体溶解后折叠 成胰岛素原,经酶处理后形成胰岛素。酵母系统生产胰岛素在1986年研究成功,在酵母中分泌表达的胰岛素原可进一步加工生产胰岛素。因此无论是用大肠杆菌系统还是酵母表达系统,都要先表达生产胰岛素原,再进一步加工成人胰岛素。提供一种制备重组人胰岛素原的简单工艺方法是大规模生产重组人胰岛素的关键。无论大肠杆菌包涵体复性液还是酵母表达培养液的过滤上清都存在着这样的特点:含有的重组人胰岛素原的浓度低;含有大量色素以及杂蛋白;料液体积大,需要后续浓缩处理,因此对工艺要求较高。中国专利技术专利CN101029077B公开了一种基因重组人胰岛素原纯化方法,其技术方案为酵母发酵液一加入活性碳一搅拌一离心一上清液一活性碳柱一透过液一阳离子柱层析一含基因重组胰岛素原洗脱液。由于毕赤酵母发酵生产重组胰岛素过程中会产生大量色素和一些杂蛋白,色素的存在严重影响下游的分离纯化,该方法采用两次活性碳处理的方法去除色素,再用阳离子柱纯化目的蛋白,然而用于脱色的活性碳易带来生产环境的污染。中国专利技术专利申请公开说明书CN1290299A公开了一种重组人胰岛素原的制备方法,该技术方案是将料液上样HP-2MG极性甲基丙烯酸酯树脂(每IL树脂Sg蛋白质的比例)后,用20mM乙酸缓冲液洗柱,然后用30%丙酮洗脱。蒸发洗脱液以除去丙酮,从而得到重组人胰岛素原,然而使用丙酮来洗脱,需要后续的蒸发步骤来除去丙酮,可能影响产品稳定性。自从1993年问世以来,扩张床吸附已广泛应用于基因工程产品的研究与开发,扩张床吸附的优势在于可直接将未经澄清带杂质的物料直接上样,免除了离心或超滤的步骤,可一步起到澄清、浓缩和初步纯化的作用。扩张床吸附技术在基因工程相关领域的应用已见报道,中国专利技术专利申请公开说明书CN1727361A公开了一种重组人干扰素a Ib的纯化工艺,该技术方案用于从表达人干扰素a Ib的工程菌种提取重组人干扰素a lb,包括细菌破碎、扩张床吸附、亲和层析和凝胶过滤步骤,从而使得生产效率大大提高,同时生产成本大大降低。中国专利技术专利申请公开说明书CN1800379A公开了一种用扩张床吸附技术及亲和层析技术制备胰激肽释放酶的方法,该技术方案在于首先用扩张床吸附技术直接初纯化猪胰提取液,再用亲和层析技术进一步纯化制得高纯度胰激肽释放酶,从而简化了生产步骤,提高了生产效率,改进了产品品质,适宜于工业化生产。但是扩张床吸附技术是否可用于酵母系统和大肠杆菌系统表达的重组人胰岛素原的纯化,还未见相关的报道。文献报道的重组人胰岛素原的制备工艺中,普遍存在的问题是生产过程复杂,含重组人胰岛素原的料液需经过至少两步或两步以上的工艺步骤才能获得纯度较高的胰岛素原,工艺步骤多导致的结果就是收率的下降和生产成本的增加。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题,本专利技术人根据胰岛素原的理化性质,经过大量的试验,筛选了更为合适的工艺条件,减少工艺步骤,提高产品收率的同时保证了产品的纯度,提供了一种制备重组人胰岛素原的新方法,该方法主要是利用了扩张床吸附技术一步从含有重组人胰岛素原的料液中捕获并纯化胰岛素原的方法。本专利技术中的起始料液为含有重组人胰岛素原的料液,即大肠杆菌表达的包涵体复性液,或酵母表达培养液的过滤上清。本专利技术的方法是利用扩张床树脂柱来制备重组人胰岛素原的,包括如下步骤:a、柱平衡:扩张床树脂柱先用流动相I平衡约3 10个柱体积,平衡流速为200 lOOOcm/h,管路中液体流向为从树脂柱底部向上流动,使柱中树脂扩张到固定床体积的I 5倍;b、上样:将含重组人胰岛素原的料液上样到扩张床树脂柱,上样流速为200 1000cm/h,管路中液体流向为从树脂柱底部向上流动,使柱中树脂扩张到固定床体积的I 5倍; C、洗涤:上样完毕,用流动相II洗涤约3 10个柱体积,洗涤流速为200 1000cm/h,管路中液体流向为从树脂柱底部向上流动,使柱中树脂扩张到固定床体积的I 5倍;d、洗脱:使树脂自然沉降,将柱顶分布器下降至树脂表面并压紧树脂,从扩张床顶部向下进液,流速调整为50 500cm/h,用流动相I1:流动相III梯度洗脱约5 20个柱体积,收集洗脱峰。本专利技术对扩张床树脂进行了优选,优选地,上述扩张床树脂为离子交换型树脂或者疏水吸附型树脂,更优选地,上述扩张床树脂为Streamline SP XL,或是Streamline QXL,或是Streamline phenyl XL,最优选地,上述扩张床树脂为Streamline SP XL。本专利技术对步骤a中的平衡扩张床树脂柱时的流动相I组分进行了优选,优选地,流动相I为盐浓度为O 1.0M的缓冲液、PH3.0 10.0的缓冲液;更优选地,流动相I为IOmM NaAc-HAc, ρΗ3.0 6.0、0 0.8Μ NaCl,或是 IOmM Tris-HCl、ρΗ8.0 10.0、0 0.8Μ NaCl ;最优选地,流动相 I 为 IOmM NaAc_HAc、pH4.0,或是 IOmM Tris-HCl、pH9.0 或是IOmM NaAc-HAc、ρΗ4.0、0.5Μ NaCl,或是 IOmM Tris-HCl、ρΗ9.0、0.5Μ NaCl。本专利技术对步骤a中扩张床树脂的平衡流速进行了优选,优选地,上述扩张床树脂的平衡流速为600 800cm/h。本专利技术对步骤a中平衡扩张床树脂时的扩张倍数进行了优选,优选地,上述扩张床树脂应扩张到固定床体积的2 4倍。本专利技术对步骤b中扩张床树脂柱上样时的流速进行了优选,优选地,上述扩张床树脂的上样流速为600 800cm/h。本专利技术对步骤b中的上样扩张床树脂时的扩张倍数进行了优选,优选地,上述扩张床树脂应扩张到固定床体积的2 3倍。本专利技术对步骤c中扩张床树脂柱的洗涤流速进行了优选,优选地,上述扩张床树脂的洗涤流速为600 800cm/h。本专利技术对步骤c中洗涤扩张床树脂柱时的扩张倍数进行了优选,优选地,上述扩张床树脂应扩张到固定床体积的2 4倍。本专利技术对步骤c中洗涤扩张床树脂柱时的流动相II组分进行了优选,优选地,流动相II为盐浓度为O 0.5M的缓冲液、PH3.0 10.0的缓冲液;更优选地,流动相II为IOmM NaAc-HAc、pH3.0 6.0,0.1 0.5M NaCl 或是 IOmM Tris-HCl、ρΗ8.0 10.0,0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备重组人胰岛素原的方法,其特征在于,利用扩张床吸附技术从含有重组人胰岛素原的料液中纯化胰岛素原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:赵志全,熊继元,隋华芹,
申请(专利权)人:鲁南新时代生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:
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